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发布时间：2021-03-19 16:28所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘要：叶绿体蛋白是植物进行光合作用所必不可缺的物质。参与光合作用的大部分叶绿体蛋白在细胞质中合成，经过TOC-TIC复合体转运至叶绿体中行使其功能。对参与叶绿体蛋白转运的TOC-TIC复合体、转运肽和分子伴侣蛋白的特征、作用及蛋白转运途径进行了总结，并
摘要：叶绿体蛋白是植物进行光合作用所必不可缺的物质。参与光合作用的大部分叶绿体蛋白在细胞质中合成，经过TOC-TIC复合体转运至叶绿体中行使其功能。对参与叶绿体蛋白转运的TOC-TIC复合体、转运肽和分子伴侣蛋白的特征、作用及蛋白转运途径进行了总结，并对近年来关于叶绿体蛋白转运研究的新发现进行了介绍和评述。
关键词：叶绿体;蛋白转运;TOC-TIC复合体;TOC;TIC
叶绿体是植物进行光合作用及合成许多基本和次要代谢物的重要场所，而叶绿体蛋白是完成这一系列反应的主要功能物质(Nelson&Ben-Shem，2004)。根据内共生起源学说，叶绿体可能起源于原核生物蓝细菌(McFadden，2001)。进化过程中叶绿体的遗传物质从原核基因组向真核细胞核中转移，所以现如今绝大多数的叶绿体蛋白都是由细胞核编码的。虽然叶绿体有其自身的基因组，但仅有大约100种叶绿体蛋白是由叶绿体基因组编码的(Martinetal.，2001;Timmisetal.，2004)，大约95%(约2000~2500种)的叶绿体蛋白质是由细胞核编码，以前体蛋白的形式存在于细胞质中，翻译后转运至叶绿体。
核基因组编码的蛋白转运至叶绿体，可为叶绿体的发育提供物质及功能基础，同时也可以调控叶绿体基因的转录、加工及翻译等过程(李保珠等，2014)，从而使叶绿体发挥正常的作用。因此研究叶绿体蛋白转运就显得尤为重要。本文主要从叶绿体蛋白转运的过程、转运复合体、转运肽及分子伴侣蛋白的特征、作用及蛋白转运途径等方面进行阐述。
1叶绿体被膜上的蛋白转运复合体—TOC-TIC
1.1叶绿体蛋白转运过程
叶绿体被膜上负责对前体蛋白识别与转运的蛋白质复合体称为易位子(Li&Chiu，2010)。叶绿体外膜上的易位子称为TOC(transloconoftheoutermembraneofchloroplasts)，内膜上的称为TIC(transloconoftheinnermembraneofchloroplasts)(Peny&Keegstra，1994;Jarvisetal.，1998;Soll&Schleiff，2004;Kessler&Schnell，2006)。位于细胞质中的前体蛋白通过叶绿体外膜和内膜上的转运通道TOC-TIC复合体进入叶绿体基质中，最终使叶绿体正常行使光合功能。
一般而言，前体蛋白转运至叶绿体分为3个阶段。早期阶段，前体蛋白N端的前导肽和叶绿体外膜蛋白转运器上受体相互作用(Clineetal.，1984)，此阶段是可逆的，需要少量ATP(100μmol·L-1)。第二阶段是前体蛋白与蛋白转运器紧密结合，进一步插入到TOC复合体，甚至与TIC 复合体接触(Perry&Keegstra，1994;Kouranov&Schnell，1997)。
此阶段的特点是前体蛋白穿过TOC复合体，与TIC复合体相结合形成转运中间体，即TOC-TIC超复合体(TOC-TICsupercomplex)(Olsen&Keegstra，1992;Nielesenetal.，1997)，此阶段的转运是定向不可逆转的，需要大约100μmol·L-1的ATP及GTP。最后阶段，前体蛋白完全跨过叶绿体内膜插入到基质中，最终被转运肽基质加工酶SPP(stromalprocessingpeptidease)移除，此阶段需要高浓度的ATP(约1mmol·L-1)(Painand&Blobel，1987;Thegetal.，1989)。
1.2TOC复合体
叶绿体外膜上的TOC复合体，主要由Toc159、Toc34和Toc75构成(Schleiffetal.，2003;Kikuchietal.，2006;Chen&Li，2007)，这些蛋白是通过其分子量大小命名的(Schnelletal.，1997)。由于豌豆(Pisumsativum)和菠菜(Spinaciaoleracea)的叶绿体相对容易提取，因此早期主要以豌豆和菠菜作为模式植物进行叶绿体蛋白转运研究(Morgenthaleretal.，1975;Hirschetal.，1994;Perry&Keegstra，1994;Schnelletal.，1994;Wuetal.，1994)。
但由于上述两种作物有限的基因组数据库限制了对其包膜蛋白的识别与鉴定。随着分子生物学的快速发展及拟南芥(Arabidopsisthaliana)模式植物地位的确立，研究者们主要以拟南芥为材料逐步鉴定出叶绿体蛋白转运的十几种转运子(translocon)(Gutensohnetal.，2000;Sohrt&Soll，2000;Schleiffetal.，2003;Ivanovaetal.，2004;Smithetal.，2004;Li&Chiu，2010)。
此外，除了Yan等(2014)对番茄(Solanumlycopersicum)TOC复合体不同成员进行基因克隆与表达分析的研究外，其他植物上几乎很少有关于TOC的报道。TOC复合体的亚基最初通过化学交联法(交联前体蛋白到邻近的多肽)，或者通过洗涤剂分离膜—复合体的方法鉴定(Ivanovaetal.，2004;Kubisetal.，2004;Smithetal.，2004;Baldwinetal.，2005)。
拟南芥中Toc159基因家族有4个同源物(atToc159、atToc132、atToc120、atToc90)，Toc34基因家族有2个同源物(atToc33和atToc34)。豌豆Toc75的同源物在拟南芥中被鉴定(Inoue&Potter，2004;Reumannetal.，2005)。研究发现，atToc75-Ⅲ缺失突变体表现为胚胎致死型，而atToc75-Ⅳ缺失表现型正常(Baldwinetal.，2005)，这表明atToc75-Ⅲ是拟南芥Toc75真正的功能序列。有关TOC基因家族成员在豌豆、拟南芥和番茄等3种作物中的进化情况，笔者从NCBI数据库中下载拟南芥、豌豆和番茄的TOC氨基酸序列，利用MEGA7.0软件中的近邻相接法(neighbor-joining,NJ)(1000Bootstrap)构建了系统进化树，显示拟南芥Toc75-Ⅲ与豌豆Toc75亲缘关系最近。
Toc159是一种位于叶绿体表面的GTP酶，可以与前体蛋白的转运肽进行特异识别，是前体蛋白与转运复合物相互作用的第一个TOC亚基(Waegemann&Soll，1991;Hirschetal.，1994;Kessleretal.，1994;Perry&Keegstra，1994)。Toc159家族成员含有3个区域：C端膜锚定结构域(M区)、中央GTP酶结构域(G区)和极酸性N端结构域(A区)。G区和M区是高度保守的，但不同物种间同系物的A区在序列和长度上变化很大(Chenetal.，2000)。
Toc159的A区与带正电荷的转运肽发生静电相互作用，从而提高了前体蛋白聚合效率(Bölteretal.，1998a)。Toc159的M区缺少疏水残基，以α螺旋形式跨越整个外膜(Kessleretal.，1994;Hirschetal.，1994)，对其在外膜的正确定位起重要的作用。Toc34也是位于叶绿体表面的GTP酶(Kessleretal.，1994)，可以与前体蛋白识别(Kouranov&Schnell，1997;Sveshnikovaetal.，2000)并通过二硫键与Toc75相互作用(Seedorfetal.，1995)。Toc34在C末端具有很短的氨基酸残基，其余均为GTP酶区域(GTPasedomain，G区)。
Toc34通过C末端单个疏水结构跨膜锚定在外膜上，而G区形成球状结构暴露于胞浆中(Kessleretal.，1994;Hirschetal.，1994;Schnelletal.，1994;Seedorfetal.，1995)。Toc75呈β桶状结构(Traneletal.，1995;Hinnahetal.，1997)嵌入外膜内，形成外被膜易位通道，帮助前体蛋白穿过外膜进入膜间隙。它的拓扑结构包括16~18条跨膜β链，形成最小直径约为14Å的水孔(Hinnahetal.，2002)，足以接受大部分未折叠的前体蛋白。由于Toc34和Toc159均可在蛋白转运的早期阶段与前体蛋白结合，因此它们都可能是蛋白转运器上的受体(Hirschetal.，1994;Baueretal.，2000;Sohrt&Soll，2000)。
前体蛋白与叶绿体外膜上TOC复合体的受体作用后，在ATP存在的情况下与TOC75结合(Perry&Keegstra，1994)，从而进行穿膜运输。至于Toc34和Toc159在蛋白转运器中的存在形式、与前体蛋白结合的先后顺序、相互间的协调过程、以及怎样将前体蛋白转运到Toc75上，目前尚不清楚。除了上述3种TOC核心复合物的组分以外，另外两个TOC复合体成分Toc64和Toc12也已被鉴定(Sohrt&Soll，2000)。Toc64也是一个嵌膜蛋白，在某些特定条件下可与其他TOC成分联合纯化，但对其参与蛋白转运至叶绿体没有直接的证据(Sohrt&Soll，2000;Schleiffetal.，2003)。目前有研究推测Toc64的功能可能与细胞质中前体蛋白与被膜上蛋白转运器的早期结合有关。Toc12通常有4个结构域：N端J结构、G&F结构、锌指结构和C末端结构(Hennessyetal.，2005)。
1.3TIC复合体
TIC复合体可以识别被运输到膜间质的前体蛋白，并将前体蛋白进一步通过内膜转运至叶绿体内。通过对离体豌豆叶绿体进行研究，鉴定出几种TIC复合体的组分，如Tic110、Tic55、Tic40、Tic22、Tic20等。
有关TIC基因家族成员在豌豆、拟南芥和番茄等3种作物中的进化情况，笔者从NCBI数据库中下载拟南芥、豌豆和番茄的TIC氨基酸序列，利用MEGA7.0软件中的近邻相接法(neighbor-joining,NJ)(1000Bootstrap)构建了系统进化树，显示番茄的Tic22和Tic40分别于与豌豆Tic22和Tic40亲缘关系最近。现有关这些组分在蛋白导入过程中所起作用的研究还相对较少，并且对于某些成分参与TIC复合体的组成也存在一些分歧，猜测在叶绿体内膜上可能存在不止一种TIC复合体。目前已经提出两种模型即TIC经典模型和TIC新模型。
1.4连接内膜和外膜的膜间桥梁—Tic236线粒体内膜与外膜上的易位子作为单独的复合物存在，仅在蛋白转运过程中临时组装成一个超级复合体(Geissleretal.，2002)。与线粒体不同，叶绿体蛋白质的转运几乎是同时穿过外膜和内膜的(Chen&Li，2017)。近期，台湾李敏秀团队在Nature上报道了拟南芥中新发现的TIC组分“Tic236”(Chenetal.，2018)，发现Tic236是必不可少的内膜蛋白，其通过N端锚定在内膜上，并且可以将230kD的结构投射到膜间空间，该结构直接与外膜通道Toc75结合;Tic236与大肠杆菌TamB5具有相似的结构域和膜拓扑结构，可以与Toc75上的POTRA结构域相互作用。
由此可知，Tic236的作用是作为膜空间内连接TOC和TIC的一个长而稳定的蛋白桥，促进前体蛋白的转运。研究还发现，减少Tic236的表达会降低叶绿体蛋白的转运速率，而Tic236敲除突变体表现为胚胎致死型，说明Tic236是叶绿体蛋白转运装置中不可缺少的组分(Chenetal.，2018)。
2叶绿体蛋白转运的多重途径
细胞核编码的叶绿体蛋白在细胞质中合成为前体蛋白后，通过叶绿体外膜和内膜上的TOC-TIC转运通道进入叶绿体的不同区域，最终使叶绿体正常行使光合功能。已有关于蛋白质转运至叶绿体的多重转运途径研究(Jarvisetal.，1998;Baueretal.，2000;Kubisetal.，2003，2004;Ivanovaetal.，2004)。研究发现，拟南芥TOC受体家族的不同成员构成不同功能不同结构的TOC复合体(Kubisetal.，2003，2004;Ivanovaetal.，2004)。
如拟南芥的两个TOC基因Toc33和Toc34很大程度上存在功能重叠(Kubisetal.，2003;Constanetal.，2004)，单个TOC受体家族成员的基因突变会影响核编码的叶绿体蛋白的积累(Jarvisetal.，1998;Baueretal.，2000;Kubisetal.，2003，2004;Ivanovaetal.，2004);Toc159受体成员功能上明显不同，绿色组织中Toc159对叶绿体合成是必要的。还有研究发现，缺失Toc159的突变体ppi2呈白化状态，表现为幼苗致死型(Baueretal.，2000)，这种致死可在培养基质中通过添加蔗糖补救(Yu&Li，2001);ppi2突变体中光合蛋白的积累量急剧下降，非光合蛋白不受影响，这说明Toc159主要负责光合蛋白的转运(Baueretal.，2000)。
3引导蛋白转运和定位的信号序列——转运肽
转运肽(transitpeptide)是指位于前体蛋白N端的一段可裂解的信号序列(Li&Chiu，2010)。转运肽对于大部分前体蛋白的转运是必需的，它包含了蛋白从细胞质中分选到叶绿体基质中整个过程所需要的所有信息(Leeetal.，2006;Chotewutmontrietal.，2017)。
转运肽的一级结构表现出极大的多样性(Leeetal.，2008;Leeetal.，2015;Li&Teng，2013)，不同的前体蛋白其转运肽序列也不同。总的来说，转运肽大致由3个部分组成：N端是一个富含疏水性氨基酸残基的区域，与被膜上的易位子结合有关;中间是富含带正电荷的氨基酸残基区域，与前体蛋白的精确转运有关;C端能形成双极性的β折叠结构，与转运肽的正确切割相关(Vothknecht&Soll，2000)。转运肽的共同特征为：
第一，转运肽N末端含有的疏水残基片段被认为是Hsp70的识别序列，这对于前体蛋白转运至叶绿体至关重要(Leeetal.，2008;Chotewutmontri&Bruce，2015)。第二，转运肽通常具有碱性残基赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)，但在它们的序列中缺少酸性残基(Bruce，2000)，这些碱性残基能促成前体蛋白有效导入叶绿体。第三，转运肽含有大量的脯氨酸残基(Leeetal.，2018)，转运肽中的脯氨酸被认为是螺旋破坏剂，对于转运肽的非结构化性质非常重要(Rensinketal.，2000);Lee等(2018)最近的研究表明，转运肽中的脯氨酸参与蛋白质的后期转运，这对于通过叶绿体被膜转运至关重要。
第四，转运肽中存在的特定序列能被胞质AtHsc70-4识别，介导胞质中未转运的前体蛋白的蛋白酶体降解以避免细胞损伤(Leeetal.，2009;Leeetal.，2016)。第五，转运肽包含特定的导入调控序列(Tengetal.，2012)，此序列将前体蛋白分为3类，一类倾向于进入幼嫩叶绿体，一类倾向于进入老化叶绿体，另一类则没有固定的偏好。还有一些叶绿体蛋白拥有特殊的转运肽。如Toc75是具有双重转运肽的外膜蛋白，其N端的转运肽将其导向叶绿体外膜后被SPP切割，C端还有一段转运肽序列可以阻止Toc75进一步向内膜转运(Tranel&Keegstra，1996)。除Toc75外，其余TOC复合体组分都没有位于N端可裂解的转运肽，它们的信号序列直接编码为成熟的蛋白质(Li&Chen，1997)。
4协助前体蛋白转运的辅助物质——分子伴侣蛋白
前体蛋白在细胞质中合成后转运时，一般都需要可以识别定位信号、协助转运的辅助物质的介导，将其定位到各个细胞器，这些辅助物质被称为分子伴侣蛋白。目前已筛选鉴定出一些可以与叶绿体前体蛋白互作的伴侣蛋白。Hsp93(ClpC)是一种可溶性基质蛋白，是第一个被鉴定为转运叶绿体蛋白的分子马达装置。Hsp93属于AAA+蛋白的Hsp100亚家族(Sauer&Baker，2011)。
它具有一个N端结构域和两个ATPase结构域，并被一个间隔子隔开(Schirmeretal.，1996)。Hsp93的N末端结构对于其与内膜结合和生物功能来说非常重要(Chu&Li，2012)。Hsp93利用ATP水解的能量推动前体蛋白通过包膜的转运(Sokolenkoetal.，1998;Halperinetal.，2001)。Hsp90C也是一种可溶性基质蛋白，是Hsp90家族中高度保守的亚家族。Hsp90C与TIC和其他伴侣蛋白协同工作，一起参与蛋白的转运，Hsp90C也可以起到转运马达的作用，这对于通过易位子进行依赖于ATP的蛋白转运来说是必不可少的(Inoueetal.，2013)。Hsp70可作为分子伴侣，在叶绿体蛋白靶向转运中起关键作用(Chiricoetal.，1988)。Hsp70包含3个结构域：ATPase结合区、底物结合区、C端多变区(Kampinga&Craig，2010)。
5结语
多年来，研究者对于TOC复合体的组分和功能似乎已经达成了共识。与TOC相比，TIC的研究起步相对较晚，目前关于TIC复合体的组分还存在着一些争议。在TIC复合物的经典模型中，Tic110被认为起着核心成分的作用。但是，在先前的文献中并没有给出确凿的证据支持Tic110和前体蛋白之间存在直接的相互作用。相反，Kikuchi和Nakai等的研究揭示了经典TIC复合物模型的一些不足，但缺乏可靠的生化证据来证明Tic110与其他已知的TIC蛋白形成复合物(Nakai，2018)。
然而，关于前人研究发现的TIC复合体在蛋白转运过程中的作用是不可否认的。因而猜测，在TIC的经典模型中其可能不与前体蛋白直接参与反应，并不是内膜上真正的易位子，可能间接地参与了前体蛋白的转运起到辅助作用。尽管发现了新型TIC复合体，并对叶绿体蛋白转运系统有了更全面的了解，但是，用这种新发现的1MDa新型模型代替经典的TIC模型可能还为时过早。
TIC新型模型还存在着许多未解决的问题：除Tic20被证明形成了膜通道以外，其余TIC蛋白的准确功能有待阐明;TOC复合物如何与新型TIC复合物进行功能合作，已知的伴侣蛋白如何帮助新型TIC转运前体蛋白，或者还存在未发现的分子伴侣;新型TIC模型在功能上是否能完全替代经典TIC模型，或新型TIC可能区别于经典TIC模型独立存在，关于这些问题还一无所知。现如今，冷冻电镜技术的发展为进一步研究TOC和TIC复合体带来了更多希望。该技术可以精确定位，甚至可以与转运蛋白相结合，帮助了解生物分子是如何执行其功能，揭示细胞里发生的生命过程细节。
生物方向评职知识：生物工程学报论文投稿要求
Park和Pfeffer等(Parketal.，2014;Pfefferetal.，2017)已经成功将该技术应用于类囊体包膜上易位子(SEC型易位子)的研究。近期，张立新团队等(Ouyangetal.，2020)首次报道了叶绿体蛋白的分选机制，发现了位于叶绿体基质的拟南芥锚蛋白分选因子STT1与STT2，阐明了双精氨酸依赖转运途径的底物识别、分选以及转运靶定到双精氨酸依赖转运途径的分子机制。总之，叶绿体蛋白转运是一个非常广阔的研究领域，目前探索到的只是冰山一角。相信在不久的将来一定能够充分阐明叶绿体蛋白转运系统的整个结构及功能机制。
作者：王琪，李云洲，须文，闫见敏*
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《叶绿体TOC-TIC蛋白复合体转运机制研究进展》