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发布时间：2021-04-02 16:39所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
[摘要]目的探究患枯萎病菊花根际与健康菊花根际土壤微生物群落的差异。方法以患病菊花植株和健康菊花植株根际土壤为研究材料，采用高通量测序技术对患病植株(A组)和健康植株(B组)样本的细菌16SrDNA和真菌ITS基因进行序列测定并进行数据分析。结果枯萎病的发
[摘要]目的探究患枯萎病菊花根际与健康菊花根际土壤微生物群落的差异。方法以患病菊花植株和健康菊花植株根际土壤为研究材料，采用高通量测序技术对患病植株(A组)和健康植株(B组)样本的细菌16SrDNA和真菌ITS基因进行序列测定并进行数据分析。结果枯萎病的发生降低了菊花根际土壤中细菌种群的丰富度和多样性程度，但对根际土壤中的真菌α-多样性无明显影响。菊花健康植株根际土壤细菌微生物中酸杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门占比高于患病植株，而变形菌门、拟杆菌门占比低于患病植株(P<0.05)。菊花患病植株根际土壤中镰刀菌属(Fusarium)真菌占比分别为27.49%、14.53%、11.94%，而健康植株镰刀菌属真菌占比分别为0.47%、1.01%、0.67%。菊花患病植株根际土壤中会出现细菌性致病菌果胶杆菌属(Pectobacterium)和菊迪基氏菌属(Dickeya)，而健康植株根际土壤中硝化类细菌、解毒类细菌、光合细菌等丰度高于患病植株。结论患有枯萎病地块菊花植株根际土壤微生物中细菌的物种多样性和丰富度降低，并大量富集镰刀菌属致病真菌和积累果胶杆菌属与菊迪基氏菌属致病细菌，而健康菊花植株根际土壤微生物有益菌占比明显高于患病株。
关键词菊花;枯萎病;根际土壤;微生物群落;高通量测序
菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，为我国药食同源中药材，具有散风清热，平肝明目，清热解毒的功效，用于风热感冒、头痛眩晕、目赤肿痛、眼目昏花、疮痈肿毒[1]。现代药理研究发现，菊花及其有效成分具有抗肿瘤、调血脂、抑菌、镇痛、免疫调节、抗疲劳等多种药理作用[2]。
生物方向评职知识：微生物学报征稿要求
当前中药材农残问题越来越受到行业关注，2020年版《中国药典》已明确要求植物类中药材禁用33种农药。中药材种植生产上病虫草害频发，是导致中药材农残超标的关键因素。我国菊花种植上存在着枯萎病、白绢病、黑斑病、炭疽病、病毒病、蚜虫等病虫害问题，导致菊花药材存在着农残超标的风险。湖北大别山区的麻城具有悠久的菊花种植历史，其种植规模达6000hm2，是我国药用菊花的主要产区之一。
近年来麻城菊花种植上7-9月的枯萎病发病较为严重，发病植株常表现为植株根系死亡，皮层腐烂脱落，木质部完全变为黑色，呈纤维状，严重时整株枯死，植株易拔出。多数田块出现整片植株死亡的现象，发病率甚至高达100%，严重影响菊花产量与农民的经济收益。我们从患枯萎病植株中筛出尖孢镰刀菌、茄病镰刀菌和少部分其他镰刀菌。
该属病菌在带病秧苗、土壤和病残体中越冬，成为次年的初侵染源，可在土壤中存活8-20年[3]，且传播速度快，在生产上往往造成毁灭性损失。麻城菊花常年采用单一化、集约化种植模式，随着种植年限的增加，田间病原菌数量也持续累加，导致病害进一步加重，使得种植户不得不放弃一些重病区的地块，并造成麻城菊花种植面积逐年萎缩，严重威胁麻城菊花产业的可持续发展。现生产上菊花病害多以化学防治为主，但该方法常常造成菊花农残超标且成效欠佳;有研究表明采用农业措施和生物措施能够有效的防控土传病害的流行发生，如增施生物有机肥[4，5]与生防制剂[6-8]可通过改善土壤微生态以控制土传病害的传播与蔓延。
药用植物根际土壤微生物群落结构组成与土壤健康状况有密切联系，对药用植物的生长发育、产量、质量和抗逆能力等有重要影响。土传病害的爆发是土壤微生物特别是根际土壤微生物群落结构失衡的结果，病害的发生打破了植物-土壤-微生物相对稳定的生态系统，深刻影响着土壤微生态环境[9]。而镰刀菌属真菌是重要植物病原菌，已引起三七[10]、白术[11]、人参[12]等药用植物根腐病，其引起的土传性病害在生产上往往难以防控，严重影响作物产量和品质。根际微生物组成既可以通过有害病原微生物的积累而导致植株的大量死亡[13]，也可以通过有益微生物的养分竞争、拮抗作用和诱导系统抗性等机制抑制土壤中病原菌，进而促进植物生长[14]。
本研究以爆发枯萎病菊花和健康植株的根际土壤为研究对象，采用高通量测序技术结合生物信息学分析菊花病株和健康植株根际土壤细菌和真菌物种组成、群落结构及多样性，从而揭示菊花枯萎病发生的根际土壤微生物多样性的差异及变化规律，为菊花枯萎病的综合防治提供参考。
1材料与方法
1.1研究区概况
研究区位于湖北省麻城市，地理坐标N31°17'16″，E115°03'02″，海拔66m，为大陆湿润性季风气候，年平均气温13-16℃，月平均最高气温7月25.9-28.2℃，年平均日照时数在1634-2229h之间，年平均降水量在1112.2-1688.7mm，全年无霜期237d。
1.2根际土壤样品采集与处理
于2019年7月在研究区进行采样，采用多点采样法取样，在试验田的发病地块(发病率100%)随机选取6个采样点进行患病植株的采集，健康地(发病率0%)块随机选取6个采样点进行健康植株的采集，且健康地块与发病地块相邻。将去除大块土壤的菊花植株根收集于50mL无菌管中，置于冰上运输至实验室。晃动根部，去除根部松散的土壤后，用DPPH缓冲液洗下残留根部土壤并进行收集;然后将各处理的2株菊花的根际土壤混匀作为一份样，最终形成3组重复，枯萎病菊花根际土壤编号为A1、A2、A3，健康菊花根际土壤编号B1、B2、B3。样品采用液氮速冻，置于-80℃冰箱保存。
1.3土壤微生物高通量测序
样品送于上海派森诺生物科技股份有限公司进行高通量测序。基于16SrDNA序列和ITS序列对土壤中细菌和真菌进行PCR扩增和产物纯化、定量和均一化构建文库并在AgilentBioanalyzer上进行质检，质检合格的文库用IlluminaHiSeq2500进行测序。为了整合原始双端测序数据，首先采用滑动窗口法对FASTQ格式的双端序列逐一作质量筛查。
随后，利用FLASH软件，对通过质量初筛的双端序列根据重叠碱基进行配对连接。根据聚类分析序列之间的相似性分为多个操作单元(operationaltaxonomicunit，OUT)，序列相似性域值设为97%，将物种OTU进行聚类和生物信息统计分析。对于不同类别的序列，分别采用各自特定的数据库作为OTU分类地位鉴定的模板序列，如针对细菌的16SrRNA基因数据库选用Silva数据库(Release132，http://www.arb-silva.de)，针对真菌的ITS序列的数据库：采用UNITE数据库(Release7.0，https://unite.ut.ee/)。
1.4测序数据分析
1.4.1OTUs分析绘制稀疏曲线可以预测样本在一系列给定的测序深度下，所可能包含的物种总数及其中每个物种的相对丰度，还可以在相同的测序深度下，比较不同样本中OTU数的多少，从而在一定程度上衡量每个样本的多样性高低。通过韦恩图可直观地呈现各样本(组)所共有和独有OTU所占的比例。
1.4.2Alpha多样性分析常用的度量指数主要包括侧重于体现群落丰富度Chao1指数和ACE指数，以及兼顾群落均匀度的Shannon指数和Simpson指数[15]。
1.4.3Beta多样性分析Beta多样性分析包括PCoA(principalcomponentanalysis)分析和样本层级聚类(hierarchicalclustering)。基于WeightedUniFrac距离进行PCoA分析，如果样本间距离相近，说明物种组成结构相似。WeightedUniFrac距离与UnweightedUnifrac距离不同的是更侧重于描述由群落成员丰度梯度的改变导致的样本差异。本研究基于WeightedUniFrac距离矩阵，采用非加权配对平均法进行层次聚类绘制系统发育树。
1.4.4物种组成分析通过数据分析6个样品在门水平上的群落结构组成情况，并通过群落柱形图分析6个样品在属水平上的群落结构组成情况。
1.5数据处理采用Excel2010软件进行统计分析，并采用T-检验进行双重比较。
2结果与分析
2.1田间病害调查
田间调查发现，麻城菊花枯萎病始发于6月中下旬，且7、8月达到峰值，田间发病率达50%~100%，9月后田间发病范围开始明显下降。发病植株会出现叶下垂、发黄、萎蔫、枯萎等症状;同一植株中也有黄化枯萎叶片出现于茎的一侧，而另一侧的叶片仍正常。正常花蕾和花的生长发育迟缓或受阻。
由于入侵维管组织的病原菌不断增殖，可观察到茎下部出现裂隙和褐变，将茎秆横切或纵切，发现其维管束变褐，有时髓部空心，向上扩展枝条的维管束也逐渐变成淡褐色，向下扩展根部外皮坏死或变黑腐烂，根毛脱落。随着疾病的发展，维管组织被阻塞，无法转运水分和所需的营养物质，最终导致植物死亡。调查麻城洪家河村的菊花种植基地时发现，有一地块菊花出现100%发病情况，而其相邻地块菊花却全部健康。
2.2患病株和健康株根际土壤OTU物种分类统计6个样品中DNA的16SrDNA经测序共分析得到410966条有效序列数据，ITS区共分析得到422576条有效序列数据，16S区序列长度主要范围为404~433bp，ITS区序列长度主要范围较广，为144~322bp。根据结果制作稀疏曲线，曲线越平缓，表明测序结果已足够反映当前样本所包含的多样性，继续增加测序深度已无法检测到大量的尚未发现的新OTU，可以看出样品OTU水平随着测序片段的增加而迅速增加，达到峰值后保持稳定，说明测序结果良好可用于后续实验分析。
患病株(A)和健康组(B)样品所共有的细菌OTUs数为2834个，其中患病植株所特有的OTUs数目分别为2140个，健康植株所特有的OTUs数目分别为3030个;患病株(A)和健康组(B)样品所共有的真菌OTUs数为540个，其中患病株所特有的OTUs数目分别为801个，健康株所特有的OTUs数目分别为926个。可以看出，健康株根际土壤中所特有的细菌和真菌OTUs数都高于患病株，特别是健康株根际土壤细菌的OTUs数高于患病株将近1000。由此说明，健康株根际土壤微生物物种丰富度高于患病株，尤其体现在两者细菌丰度度的差异上。
2.3患病株和健康株根际土壤微生物群落α多样性影响
从Shannon、Simpson、Ace和Chao1指数可得，健康株根际土壤细菌的物种多样性和物种丰富度都高于患病株，且丰富度指数存在显著差异。健康株根际土壤真菌的物种多样性略高于患病株，而丰富度略低于患病株。可以得知，重病地中枯萎病的发生对菊花根际土壤细菌物种多样性和物种丰富度的影响较大，而对根际土壤真菌物种多样性和物种丰富度几乎无影响。
2.4患病株和健康株根际土壤微生物群落β多样性影响
在OTU水平对β多样性进行评估，比较患病株与健康株细菌和真菌群落结构组成，用主坐标分析(principalcoordinateanalysis，PCoA)显示样本中细菌和真菌群落结构的整体有所差异，可以看出患病株和健康株细菌和真菌群落的相对分散程度不同，健康株菊花根际土细菌和真菌的微生物群落较为集中，3组的重复数据距离并不远，说明重复较好，且与患病株的样本组成可以很好分开，而患病株菊花根际土细菌和真菌的微生物群落较为分散，说明患病株组内微生物群落相似性低。采用加权组平均法(Unweightedpair-groupmethodwitharithmeticmeans，UPGMA)对样品进行样本层级聚类分析。患病株三组细菌和真菌分别聚在一类，健康株三组细菌和真菌分别聚在一类，说明患病株相对于健康株的根际土壤真菌、细菌群落组成有很大不同。结果表明，无论是细菌还是真菌，患枯萎病植株和健康植株根际土壤样本间的距离相差较大。
2.5患病株和健康株根际土壤微生物组成比较
患病株和健康株根际土壤中丰度最大的十个门类分别是：变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)、Patescibacteria、疣微菌门(Verrucomicrobia)、厚壁菌门(Firmicutes)、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)。其中优势变形菌门(Proteobacteria)在患病株和健康植株根际土壤中占比最高，分别为64.00%±13.62%(A)、45.07%±0.62%(B)，其次是酸杆菌门(Acidobacteria)，分别占4.80%±1.44%(A)和16.97%±1.18%(B)，第三为放线菌门(Actinobacteria)，分别占6.87%±2.27%(A)和8.43%±0.76%(B)。另外，患病株和健康植株根际土壤中芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)存在显著差异，分别占2.47%±1.11%(A)和7.30%±1.42%(B);患病株和健康植株根际土壤中硝化螺旋菌门(Nitrospirae)存在极显著差异，分别占0.33%±0.12%(A)和1.57%±0.12%(B)。
患病株和健康植株根际土壤中的优势真菌种群在门水平的丰度分布主要有子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、罗兹菌门(Rozellomycota)、被孢霉菌门(Mortierellomycota)，其中子囊菌门(Ascomycota)患病株和健康植株根际土壤中丰度最大，分别占比为76.73%±4.88%(A)、58.83%±9.72%(B)，其次是担子菌门(Basidiomycota)，分别占比为3.70%±1.85%(A)、19.43%±6.25%(B)，且两者存在显著差异。丰度分析表明，健康株根际土壤细菌微生物中酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、Patescibacteria、疣微菌门、硝化螺旋菌门占比高于患病植株，而变形菌门、拟杆菌门占比低于患病植株。健康株根际土壤真菌微生物中子囊菌门的占比低于患病株，而担子菌门和罗兹菌门、被孢霉菌门的占比高于患病株。
患病植株根际土壤所特有的菌属有果胶杆菌属(Pectobacterium)、菊迪基氏菌属(Dickeya)和肠杆菌属(Enterobacter)，其中果胶杆菌属(Pectobacterium)和菊迪基氏菌属(Dickeya)在A1组占比为29.48%、18.28%，在A2组也有少部分占例，分别为3.06%、1.92%。健康植株根际土壤所特有的菌属为MND1，且未培养的芽单胞菌科(Uncultured_Gemmatimonadaceae)、Candidatus_Solibacter、Haliangium、Bryobacter、未培养的酸杆菌(uncultured_Acidobacteria_bacterium)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)丰度显著高于患病植株根际土壤。
患病植株根际土壤的镰刀菌属(Fusarium)明显高于健康植株根际土壤，患病植株镰刀菌属真菌占比分别为27.49%、14.53%、11.94%，而健康植株镰刀菌属真菌占比分别为0.47%、1.01%、0.67%。患病株根际土壤真菌中Apiotrichum、Solicoccozyma、Acrophialophora与健康植株根际土壤存在极显著性差异，且Massaria、Saitozyma、Sagenomella存在显著性差异。患枯萎病植株的根际土壤细菌和真菌群落结构与健康植株有很大的差异，重病田中患有枯萎病菊花植株根际土壤微生物中镰刀菌属致病菌出现富集，且伴随有致病细菌的积累，而健康田中健康菊花植株根际土壤微生物有益菌占比明显高于患病株。
3讨论与结论
有研究认为土壤细菌的数量和多样性的高低在一定程度上反映了土壤的健康状况，当根际微生物特别是细菌区系结构合理，物种多样性程度和丰富度越高，作物抗病能力就越强[16]。本研究中α-多样性分析表明患病株的细菌物种多样性和丰富度低于健康株，而真菌多样性差异较小，这与邓晓等[17]以香蕉枯萎病患病样地的健康植株与患病植株根区土壤细菌为研究对象，得出患病香蕉根区土壤细菌多样性指数及丰富度指数均低于健康植株的结果相似。伍文宪等[18]研究根肿病侵染十字花科作物后，发现病株根际土壤与健康株根际土壤优势菌群结构差异明显，本研究中β-多样性分析结果表明患病植株根际土壤微生物群落的组成和丰度与健康植株根际土壤存在较大差异。
对2种生境的优势细菌种群在门水平分析表明，健康株根际土壤细菌微生物中酸杆菌门、放线菌门、绿弯菌门、芽单胞菌门、Patescibacteria、疣微菌门、硝化螺旋菌门占比均高于患病植株，并对2种生境的优势细菌种群进行属水平上的分析，发现果胶杆菌属(Pectobacterium)、菊迪基氏菌属(Dickeya)这些常见的病原菌为患病植根际土壤所特有的菌属，而MND1，未培养的芽单胞菌科(Uncultured_Gemmatimonadaceae)、Candidatus_Solibacter、Bryobacter、未培养的酸杆菌(uncultured_Acidobacteria_bacterium)、硝化螺旋菌属(Nitrospira)这些有益菌群丰富度均显著低于健康植株根际土壤。对患病植株和健康植株根际土壤真菌进行属水平上的分析，发现患病植株根际土壤中镰刀菌属(Fusarium)真菌占比分别为27.49%(A1)、14.53%(A2)、11.94%(A3)，而健康植株镰刀菌属真菌占比分别为0.47%(B1)、1.01%(B2)、0.67%(B3)。
从麻城菊花重病地收集的病株中筛选出的致病菌也为镰刀菌属真菌，可以推断出菊花根际土壤中镰刀属真菌占比与菊花植株病害发生息息相关。由此可见患枯萎病植株土壤中的根际微生态发生了重大变化，微生物种类减少，多样性水平下降，特别是有益微生物的种类极其数量都大量降低，病原菌上升，群落结构发生倾斜，植物的生存空间遭到极大的破坏，无法正常发育，进而影响到菊花的连续生产。
药用种植过程中出现连作障碍的现象非常普遍，特别在一些道地产区出现连作障碍现象更为明显。研究表明随土壤连作年限的增加，会出现有益微生物量逐渐减少，而有害微生物量却逐渐增加的现象[19]，并且会出现由高肥力的细菌型土壤转变为低肥力的真菌型土壤的现象[20]，这种根际微生物群落结构失调及病原菌数量增加是造成药用植物连作障碍的原因之一。刘晓珍等[21]对盐城药用菊花连作障碍形成原因进行初步研究时发现，随着种植年限的增加，土壤真菌化严重，细菌和放线菌数量在15年显著降低，且连作15年的菊花产量仅为初茬菊花产量的19.80%。
本研究中重病地为连作地，枯萎病的爆发使连作地中病原菌数量急剧增加，导致土壤群落结构严重失调，进一步加剧菊花产量缩减，给农户带来巨大损失。本研究仅从对重病田中患枯萎病植株和健康田中健康植株的根际土壤微生物的群落组成进行了研究，发现患枯萎病菊花根际土壤中致病菌丰度占优势，有益菌数量大大缩减;而对麻城菊花连作障碍的形成机制及缓解措施有待于进一步探究。
[参考文献]
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[S].北京:中国医药科技出版社，2020:323-324.
[2]瞿璐，王涛，董勇喆，张静慧，张祎.菊花化学成分与药理作用的研究进展[J].现代药物与临床，2015，38(1):98-104.
[3]SINGHPK，KUMARV，FusariumwiltofChrysanthemum–problemsandprospects[J].PlantPathology&Quarantine，2014，4(1):33-42.
[4]王超，李刚，黄思杰，等.枯草芽胞杆菌菌肥对有机冬瓜根区土壤微生态的影响[J].微生物学通报，2019，46(3):563-576.
作者：陈巧环1，苗玉焕1，王铁霖2，郭兰萍1，2，刘大会1*
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《枯萎病对菊花根际土壤微生物群落结构的影响》