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发布时间：2021-05-08 17:26所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘要：宏基因组学是指环境中所有微生物的遗传物质总和。宏基因组学技术可以最大限度地利用环境中的微生物资源，受到了国内外微生物研究学者的重点关注。口腔中寄居着大量的微生物群落，以往对口腔疾病微生物的研究大多局限于单纯细菌培养技术，然而，由于培
摘要：宏基因组学是指环境中所有微生物的遗传物质总和。宏基因组学技术可以最大限度地利用环境中的微生物资源，受到了国内外微生物研究学者的重点关注。口腔中寄居着大量的微生物群落，以往对口腔疾病微生物的研究大多局限于单纯细菌培养技术，然而，由于培养技术的局限性，部分微生物很难或根本不能培养，宏基因组学技术将打破这一局限性，帮助人类发掘更丰富的口腔微生物资源。最近以宏基因组学测序为基础的研究描绘出了口腔生态系统的图谱，越来越多的实验证明了口腔微生物组在各种口腔疾病甚至全身系统性疾病中的重要作用。同时，这也为基于人类微生物组的诊断和治疗开辟了新的途径。本综述旨在说明宏基因组学是研究人类口腔疾病及全身疾病相关微生物的得力工具，且具有广阔的发展前景，同时也讨论了宏基因组学在应用中有待克服的局限性。
关键词：宏基因组学，口腔微生物，口腔疾病，宏基因组测序
口腔微生物组作为人体五大菌库之一，因其与人类口腔疾病甚至全身系统性疾病的发生发展密切相关而受到了广泛关注[1]。以往对口腔疾病微生物群落的研究大多局限于单纯细菌培养技术，但往往效率不高，且具有培养局限性。根据最新扩展的人类口腔微生物组数据库(HumanOralMicrobiomeDatabase，HOMD)可知，只有57%的口腔细菌种类得到了正式命名，13%的口腔细菌种类被培养但未命名，而30%的口腔细菌尚未被培养得到[2]。
微生物评职知识：微生物学报征稿要求
随着宏基因组测序技术和下一代测序(Next-GenerationSequencing，NGS)平台的进步，有可能获得之前依靠传统培养技术不能得到的口腔微生物。宏基因组学是一种微生物研究方法，也可称元基因组学，其研究对象是环境微生物的全部基因组，研究手段是功能筛选和测序分析，目的是研究微生物的多样性、相互关系、种群结构、基因功能等。
宏基因组学技术目前常用的2种方法包括全宏基因组散弹测序(WholeMetagenomeShotgunSequencing，WMS)和16S核糖体RNA扩增子测序(16SRibosomalRNAAmpliconSequencing)，这2种方法都需要读取样本中存在的微生物的16SrRNA基因序列，并将它们与序列数据库进行对比，以确定该样本中存在的不同微生物的相对数量及多样性等。
宏基因组学技术的运用使微生物间相互作用与基因组和空间信息结合起来，打破了传统微生物分离培养技术的局限性，能极大地拓宽了微生物资源的利用空间，通过对口腔微生物的深入研究得以全面了解口腔微生物菌群结构及功能、揭示微生物与口腔疾病间的关系，从而为临床上口腔疾病的防治提供理论基础，已经成为国际生命科学以及微生物研究中最重要的前沿和热点[3]。
1宏基因组学
宏基因组学的发展经历了环境基因组学、微生物基因组学到人类宏基因组学的阶段。1991年Schmidt等[4]通过使用最小化特定序列选择的方法，对太平洋微浮游生物种群的16SRrna基因序列进行了表征，提出了环境基因组学的概念，并构建了第一个通过克隆环境样品DNA得到的噬菌体文库。1998年人类正式启动了环境基因组计划，此项计划由美国环境健康科学研究所首次提出。后来随着微生物领域的进展，特定环境中的微生物逐渐受到人类的重点关注。1998年，Handelsman等[5]率先提出了宏基因组学，指环境中所有微小生物的遗传物质总和。宏基因组学基本技术流程如下。
1.1环境样品总DNA的提取提取高质量的样本总DNA是构建宏基因文库重要的一步[6]。现在市面上已有多种DNA提取试剂盒，并且很多学者仍在继续探索改良宏基因组DNA的提取方法[7]。
1.2宏基因组文库的构建[8]
1.2.1载体系统选择载体在促使宏基因或基因簇在重组克隆子中表达或提高表达量中起着十分重要的作用。通常用于DNA克隆的载体包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。
1.2.2宿主系统选择克隆中宿主菌株的选择主要考虑到转化效率、稳定性以及目标性状的筛选等。常用的宿主主要有大肠埃希菌以及链霉菌属和假单胞菌属，其中大肠埃希菌是最为理想和常用的宿主。
1.2.3转化在宏基因组克隆中，转化即是指通过合适的方法使宿主细胞处于感受态。有CaCl2法和电转化法2种，目前一般采用电转化法。
1.3宏基因组文库的筛选宏基因组文库的筛选技术大致可分为4类[9]。
1.3.1功能驱动的筛选功能驱动的筛选特点是只对能在宿主中表达的基因进行筛选，依据其表达特性可筛选到人类需要的酶类、抗生素类等产物[10]。其局限性为：此种筛选法工作量大、效率相对较低。
1.3.2序列驱动的筛选序列驱动的筛选的特点是根据现有的已知功能序列进行筛选。其局限性为：无法筛选得到与已知功能序列不相同的新基因。
1.3.3化合物结构水平的筛选化合物结构水平的筛选特点是根据化合物的结构不同进行筛选，可以筛选出具有新结构的化合物。其局限性为：筛选出的新化合物可能无生物活性，筛选成本高。
1.3.4底物诱导的筛选底物诱导的筛选特点是通过利用底物诱导目标基因表达来进行筛选。其局限性为：对目标基因的结构性和适应性很敏感，并且不能利用无法进入细胞质的底物[11]。在适用的条件下，这种筛选方式可以成为一个非常有效的工具，特别是对于工业，可以用来筛选与抗生素生产或小分子诱导的生物催化剂等相关的基因[12]。
2宏基因组学在口腔微生物研究领域的大应用由于口腔微生物与人类健康密切相关，对口腔微生物的培养与研究由来已久。传统的微生物多样性研究依赖于分离培养技术，仍有30%的口腔微生物种群无法被培养得到[2]。近年来，随着宏基因组学技术的发展，丰富了口腔微生物研究的成果，从整体上揭示了人体口腔微生物组的多样性及群落功能。宏基因组学技术在口腔微生物研究领域主要应用于2个方面。
2.1口腔微生物群落结构多样性和相互关系的研究
宏基因组学技术的应用可揭示口腔微生物群落多样性、种群结构及其变化、微生物间相互关系及微生物与口腔不同环境间的关系;运用的技术手段主要为16S核糖体RNA(RibosomalRNA，rRNA)编码基因测序和DNA-DNA杂交芯片(如美国福赛斯研究中心开发的人类口腔微生物芯片);人类口腔微生物组数据库储存了人类口腔微生物的丰富信息，其是由美国福布斯研究中心和英国国王学院于2008年创建的，之后随着宏基因组学在口腔微生物领域的不断应用，越来越多的实验研究丰富了此数据库成果。Wu等[13]通过16SrRNA基因序列分析了具有不同患龋经历的同卵双胞胎唾液和牙菌斑中的微生物群落，并测定了各分类群的丰富度、多样性和相对丰度的差异，结果表明患龋者唾液中链球菌、奈瑟氏菌、嗜血杆菌和韦龙氏菌的比例较高，牙菌斑中奈瑟氏菌、棒状杆菌、卟啉单胞菌和细毛菌比例较高，为探索遗传及环境因素对人体口腔微生物群组多样性及菌群构成的影响提供了理论基础。
Luo等[14]通过16SrRNA基因微阵列芯片技术测定儿童唾液细菌谱，共检出94种菌群，分属于6个细菌门30个属，且在患者中观察到的菌群多样性高于在健康样本中观察到的菌群多样性，从而为龋病病因学研究提供依据。运用宏基因组学技术发现健康人口腔中的菌群组成大多是相似的，这就提示了“口腔核心微生物组”的存在[15]，即在不同的健康个体口腔中相同的口腔微生物组，这些丰富的口腔核心微生物组将维持健康口腔生态系统的动态平衡和功能稳定性。Takeshita等[16]利用16SrRNA基因下一代高通量测序技术，确定了日本久山镇2343名成年居民的唾液微生物区系组成。在已鉴定的550个种级操作分类单元中，72个分类单元是共同的，占所有个体的75%，这支持了健康“口腔核心微生物组”的概念。
3宏基因组学在口腔疾病及全身疾病相关微生物的研究进展
随着宏基因组学的运用，人类对口腔微生物的认识逐渐深入，越来越多的证据表明[1,23]口腔微生物组在各种健康状况中扮演着重要角色，不仅包括口腔疾病，还有全身系统性疾病[24]。这表明口腔微生物区系可能为口腔疾病及某些系统性疾病的诊断和治疗提供潜在的生物标志物。
3.1宏基因组学在牙周病微生物中的研究
牙周病是由于口腔微生物和宿主免疫之间相互作用导致的较为复杂的慢性炎症性疾病[25]。深入了解牙周病相关微生物群的结构对于牙周病的诊断以及促进临床精准诊疗至关重要。过去几十年里，很多学者通过研究发现了牙周病相关微生物，例如伴放线聚集杆菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛氏类杆菌、齿垢密螺旋体、核梭杆菌和中间普氏菌等[26-27]。
近年来随着宏基因组学等分子生物学技术的运用，对牙周病微生物多样性的研究已有许多，多项研究发现在牙周病患者中卟啉单胞菌属、密螺旋体属、小单胞菌属、纤溶因子属的数量较多，而在健康对照组中链球菌、普氏菌属、月形单胞菌属、罗氏菌属含量较高[28-30]，另外在功能研究方面也进行了探究，除了一些已知的牙周病原体外，宏基因组学技术还发现了新的病原体，如：拟杆菌科(未鉴定的科)、白色念珠菌、肠杆菌科(未鉴定的菌种)、TM7属(TM7spp.)等[31]。
通过比较宏基因组学的分析结果，可以试图揭示牙菌斑微生物群落相互作用的机制，并在全基因组范围内表征与牙周炎相关的细菌制剂及其功能[32]，从而为牙周病微生物的精准治疗提供依据。因此后续对牙周病微生物研究应在扩大样本量的基础上对测序数据继续进行深入分析，寻找更多的差异菌群及差异功能基因之间的作用机制，并需要进一步验证差异物种与相关小分子代谢通路的具体联系，从而更进一步了解完善口腔微生物在牙周炎发生发展中的作用机制。
4展望
口腔微生物群落的结构特征和功能分析可作为口腔以及全身健康检测的重要标记，对这些微生物的基因进行全面测序以及对它们的生理功能进行深入解析，可为人体各类口腔疾病甚至全身疾病的预防和治疗带来全新的思路和方法。宏基因组学技术使全面深入研究可培养与不可培养口腔微生物组成为可能，但目前口腔微生物组在宏基因组学功能基因层面的研究仍有一定的局限性，比如靶基因在宿主细胞中的表达不佳，以及对基因产物的活性检测效率低下等，这就需要我们开发新的高通量的工具扩展宏基因组筛选的范围。
其次只利用宏基因组学技术尚不能从基因水平上很好地解释生态系统的动态性及微生物与环境之间的相互作用特征，结合其他方法如宏转录组、宏蛋白质组和宏代谢组分析等宏组学技术，可能为口腔微生物组的功能动力学提供更好的前景;再者宏基因组学数据测量具有变异性和复杂性，导致跨研究的整合分析方面十分困难，因此有必要进一步努力使宏基因组学数据库标准化，这将需要进行更多的大规模和纵向试验研究。相信随着全基因组测序数据质量的提高和测序成本的降低，未来引入临床诊断将成为可能，可以快速地诊断甚至可以预测出一些常见及不常见的口腔疾病及全身疾病的发生，通过早期干预和诊疗降低发病率。
综上，宏基因组学技术的不断发展为口腔微生物的研究提供了更加前沿的手段和更广阔的舞台，在口腔微生物研究领域中有很多未知奥秘等待着我们去探索，有更多空白需要我们去填补。
REFERENCES
[1]ZhangYH,WangX,LiHX,NiC,DuZB,YanFH.Humanoralmicrobiotaanditsmodulationfororalhealth[J].Biomedicine&Pharmacotherapy,2018,99:883-893
[2]EscapaIF,ChenT,HuangYM,GajareP,DewhirstFE,LemonKP.NewinsightsintoHumannostrilmicrobiomefromtheexpandedhumanoralmicrobiomedatabase(eHOMD):aresourcefortheMicrobiomeoftheHumanAerodigestiveTract[J].mSystems,2018,3(6):e00187-18
[3]Escobar-ZepedaA,Vera-PoncedeLeónA,Sanchez-FloresA.Theroadtometagenomics:FrommicrobiologytoDNAsequencingtechnologiesandbioinformatics[J].FrontGenet,2015,6:348
[4]SchmidtTM,DeLongEF,PaceNR.Analysisofamarinepicoplanktoncommunityby16SrRNAgenecloningandsequencing[J].JournalofBacteriology,1991,173(14):4371-4378
[5]HandelsmanJ,RondonMR,BradySF,ClardyJ,GoodmanRM.Molecularbiologicalaccesstothechemistryofunknownsoilmicrobes:anewfrontierfornaturalproducts[J].Chemistry&Biology,1998,5(10):R245-R249
作者：李玉姣1钱飞2王丹1田宇1
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《宏基因组学及其在口腔微生物研究中的应用》