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发布时间：2021-05-12 17:03所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘要目的:优化车前草中桃叶珊瑚苷的提取工艺,并确定大孔树脂分离纯化桃叶珊瑚苷的工艺。方法:以桃叶珊瑚苷含量和干膏率的综合评分为评价指标,乙醇浓度、溶剂倍数、提取时间为考察因素,正交试验法优化提取工艺;然后以桃叶珊瑚苷含量为指标,考察大孔树脂种类、
摘要目的:优化车前草中桃叶珊瑚苷的提取工艺,并确定大孔树脂分离纯化桃叶珊瑚苷的工艺。方法:以桃叶珊瑚苷含量和干膏率的综合评分为评价指标,乙醇浓度、溶剂倍数、提取时间为考察因素,正交试验法优化提取工艺;然后以桃叶珊瑚苷含量为指标,考察大孔树脂种类、树脂用量、水洗脱剂用量,洗脱液乙醇浓度、乙醇用量对分离纯化工艺的影响,优选分离纯化工艺并通过中试验证。结果:提取工艺为:加入12倍量70%乙醇,回流提取90min,提取2次;然后采用S-8大孔树脂对提取物进行分离纯化,加入2倍量大孔树脂,4倍量水洗脱除杂后,再用5倍量65%乙醇洗脱,收集乙醇洗脱液。结论:该提取、分离和纯化工艺简单、可行,产品纯度高,得率可观,适合于车前草中桃叶珊瑚苷的提取、分离纯化工业化生产。
关键词车前草;桃叶珊瑚苷;提取;分离;纯化
车前草为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥全草,具有清热利尿通淋、祛痰、凉血、解毒的功效,用于治疗热淋涩痛、水肿尿少、暑湿泄泻、痰热咳嗽、吐血衄血、痈肿疮毒等〔1〕。桃叶珊瑚苷为车前草主要活性成分之一,药理作用广泛,包括抗氧化及抗光老化作用、抗炎作用、保肝作用、抗菌作用、降血糖作用、抗肿瘤作用、保护心血管作用等〔2-6〕,为提高车前草资源的利用率,为桃叶珊瑚苷的工业化生产奠定基础,笔者拟从车前草中提取分离纯化桃叶珊瑚苷的工艺进行优化。
1仪器与材料
1.1仪器1120CompactLC型高效液相色谱仪(美国Agilent公司);AgilentTC-C18柱(250mm×4.6mm,5μm);XS205DU型电子分析天平(梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司);KQ-200KDB型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2材料实验用车前草购自广西玉林,由广西中医药大学银胜高副教授鉴定为车前科植物车前PlantagoasiaticaL.或平车前PlantagodepressaWilld.的干燥全草;桃叶珊瑚苷对照品(批号:110709-200304,中国食品药品检定研究院);D101大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);AB-8大孔树脂、S-8大孔树脂(天津波鸿树脂科技有限公司);D4020大孔树脂(天津南开和成科技有限公司);HPD100大孔树脂(西安蓝晓科技新材料股份有限公司);乙腈、甲醇为色谱纯;无水乙醇等为分析纯;超纯水。
2方法与结果
2.1桃叶珊瑚苷的含量测定
2.1.1色谱条件与系统适应性〔7〕:色谱柱AgilentTC-C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水=20∶80;流速:1.0mL/min;检测波长:210nm;进样量为10μL;柱温为室温。此条件下理论板数均在3000以上,其他成分无干扰。
2.1.2对照品溶液的制备:精密称取桃叶珊瑚苷对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇溶解制成0.0621mg/mL的对照品溶液,即得。
2.1.3供试品溶液的制备:精密称取提取物粉末1g,置于100mL棕色锥形瓶中,加入甲醇50mL,称重,超声(300W,50kHz)提取30min,放冷,再次称重,甲醇补足损失的重量失重,摇匀,微孔滤膜滤过,取续滤液,然后取续滤液1mL稀释到10mL,即得。
2.1.4线性关系考察:分别精密吸取桃叶珊瑚苷对照品溶液0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0μL,按“2.1.1”项下色谱条件测定峰面积,以进样量(μg)为横坐标(X),峰面积为纵坐标(Y),绘制标准曲线,得回归方程Y=22405X+169.2(r=0.999)。结果表明桃叶珊瑚苷在0.0311~0.4968μg范围内呈良好的线性关系。
2.1.5精密度试验:精密吸取对照品溶液10μL,注入液相色谱仪,连续进样6次,按“2.1.1”项下色谱条件测定桃叶珊瑚苷峰面积,RSD为1.05%(n=6),表明仪器精密度良好。
2.1.6重复性试验:分别精密称取同一提取工艺提取物6份,按“2.1.3”项方法制备,再按“2.1.1”项色谱条件测定桃叶珊瑚苷峰面积,RSD为1.30%(n=6),表明方法重复性良好。
2.1.7稳定性试验:分别取对照品溶液和供试品溶液,室温放置24h,分别于0、2、4、6、8、12、24h按“2.1.1”项下色谱条件进样10μL,测定得到桃叶珊瑚苷峰面积RSD分别为1.15%、1.22%(n=7),表明对照品溶液和供试品溶液在24h内稳定性良好。
2.1.8加样回收率试验:取已知含量提取物6份,每份约1.0g,分别精密加入对照品溶液适量,按“2.1.3”项方法制备,按“2.1.1”色谱条件测定桃叶珊瑚苷含量,计算加样回收率。结果桃叶珊瑚苷的平均加样回收率为99.96%(n=6)。
2.2干膏率的测定精密吸取提取液20mL,置于恒定质量的蒸发皿中,按2015版中国药典四部“干燥失重测定法”进行测定,计算干膏率。
2.3综合评分(Z)的计算以桃叶珊瑚苷含量和干膏率作为评价指标,权重系数分别为80%和20%,综合评分(Z)=桃叶珊瑚苷含量/桃叶珊瑚苷含量最大值×100×80%+干膏率/干膏率最大值×100×20%。
2.4提取工艺的优化
2.4.1单因素试验:
以乙醇浓度(A)、溶剂倍数(B)、提取时间(C)为主要影响因素,分别考察其对提取工艺的影响。乙醇浓度(A):精密称取5份车前草粉末(过2号筛)200g,分别加入20倍量的25%乙醇、40%乙醇、55%乙醇、70%乙醇、90%乙醇,回流120min,提取2次,合并提取液。溶剂倍数(B):精密称取5份车前草粉末(过2号筛)200g,分别加入8、10、12、14、18倍量的50%乙醇,回流120min,提取2次,合并提取液。提取时间(C):精密称取5份车前草粉末(过2号筛)200g,加入20倍量50%乙醇,分别回流提取30、60、90、120、150min,提取2次,合并提取液。各提取液分别按“2.1.1”“2.2”项下测定并计算桃叶珊瑚苷含量和干膏率。
结果表明,乙醇浓度(A):当乙醇浓度达到70%时,桃叶珊瑚苷含量和干膏率均为最高,故乙醇浓度(A)选择55%~90%;溶剂倍数(B):当溶剂倍数为10倍以上时,桃叶珊瑚苷含量和干膏率均趋于平衡,故溶剂倍数(B)选择10~14倍;提取时间(C):当提取60~120min时,桃叶珊瑚苷含量和干膏率均趋于峰值,提取时间为150min时,桃叶珊瑚苷含量和干膏率均呈下降,故选择提取时间60~120min。因此,以上述条件安排正交试验。见表1。
2.4.2因素水平安排:依据“2.4.1”项结果,以乙醇浓度(A)、溶剂倍数(B)、提取时间(C)为考察因素并按L9(34)正交试安排正交试验。
2.4.3正交试验结果:每个实验平行进行3次,按“2.1.1”和“2.2”项测定桃叶珊瑚苷含量和干膏率,取平均值,并按“2.3”计算综合评分(Z)。直观分析结果(表3)显示:各因素影响次序为乙醇浓度(A)>溶剂倍数(B)>提取时间(C),最佳提取工艺为A2B2C2。方差分析结果(表4)表明:乙醇浓度(A)、溶剂倍数(B)综合评分均具有显著性差异,提取时间(C)无显著性差异,提取时间(C)中K2明显大于K1、K3值。综合工业化生产和能耗等方面考虑,确定该工艺条件为A2B2C2,即加入12倍量70%乙醇,回流提取90min。
2.5提取工艺验证实验称取适量车前草粉末3份,精密称定,按“2.4”项方法提取样品,并按“2.1.1”和“2.2”项测定桃叶珊瑚苷含量和干膏率,再按“2.3”项方法计算综合评分(Z),桃叶珊瑚苷含量均值为2.1537mg/g,RSD为0.92%;干膏率均值为11.71%,RSD为1.02%。
2.6分离纯化工艺的优化
2.6.1粗提溶液的制备:按照“2.4”项下优化的方法提取,取滤液,保存备用。(桃叶珊瑚苷含量2.1602mg/mL,1mL相当于1g药材)。
2.6.2五种吸附树脂的考察:取预处理的5种不同树脂各100g,并取粗提溶液50mL上样,分别用500mL水、500mL50%乙醇依次洗脱,流速2.0mL/min,收集洗脱液,按“2.1.1”项下色谱条件测定桃叶珊瑚苷含量,计算吸附率。
结果表明,S-8大孔树脂对桃叶珊瑚苷的水洗脱液中桃叶珊瑚苷含量为1.07mg/mL,吸附率76.83%,在乙醇洗脱液中吸附率达到92.15%,在水洗脱和乙醇洗脱中吸附效果均较好,考虑吸附、解吸因素,选择S-8大孔树脂作为吸附树脂。2.6.3树脂用量考察:取粗提溶液50mL三份,按照药材∶树脂(1∶1,1∶2,1∶3,1∶4)分别取S-8树脂50、100、150、200g,上样,分别依次用400mL水和400mL50%乙醇洗脱,收集50%乙醇洗脱液,按“2.1.1”项下色谱条件测定桃叶珊瑚苷含量,计算吸附率。
结果表明,药材∶树脂为1∶2时,桃叶珊瑚苷含量达到1.44mg/mL,吸附率达到92.35%,且随着比例(药材∶树脂)的增加,吸附率趋于稳定,桃叶珊瑚苷含量趋于平衡状态。因此,以比例(药材∶树脂)1∶2~1∶4安排正交试验。
2.6.4水洗脱用量考察:取100gS-8大孔树脂装柱,吸取50mL粗提溶液上样(相当于50g药材),用300mL水洗脱(相当于药材量的6倍量),流速2mL/min,每50mL收集一个流份,共收集6份。测定水洗脱液中桃叶珊瑚苷含量,然后使洗脱液浓缩、干燥、称重,得固体含有量。
试验结果表明,用3倍量水洗脱时,固体含有量最高,达到133.6mg,4倍量水洗脱时,洗脱液中桃叶珊瑚苷含量达到峰值,为1.22mg/mL,固体含有量为115.3mg。考虑到水洗脱的目的在于最大程度的除去杂质成分,同时尽可能保留桃叶珊瑚苷,减少目标产物的损耗。因此,选择以3~5倍水洗脱量安排正交试验。
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3讨论
在提取工艺研究中,本研究比较了回流提取法、超声提取法、冷浸法等三种不同的提取方法,结果表明回流提取法的提取效率较好。另外,笔者还对药材原料分别采用回流提取法提取1~5次,提取2次和3次的效果相当,提取次数达到3次以上时,桃叶珊瑚苷含量和干膏率无明显区别,故本文试验中均为提取2次。
一方面,本试验比较了五种不同型号大孔树脂对桃叶珊瑚苷的吸附影响,结果显示极性的S-8大孔树脂对桃叶珊瑚苷的吸附效果最佳,桃叶珊瑚苷在溶液中也容易被S-8大孔树脂洗脱分离;最后选择该大孔树脂对目标成分进行分离纯化。另一方面,另外,本试验对四个影响因素(树脂用量、水洗脱用量、洗脱液乙醇浓度、洗脱液乙醇用量)分别进行考察,并在此基础上进行正交试验,优选分离纯化工艺。经过大孔树脂分离纯化得到的产品纯度>82%,重结晶后产品纯度高达98%以上,产率为1.1g/kg。本实验优化的提取、分离纯化工艺路线简单、稳定、可兼顾目标产物含量和生产成本,适用于工业化生产的需要。
参考文献
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作者：黄健军1,2,谢冬养3,梁爽1,2∗,唐冬伟1,韦朝红1
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《车前草中桃叶珊瑚苷的提取、分离纯化工艺研究》