CRISPR/Cas9技术在作物遗传育种中的应用进展

发布时间：2021-06-01 17:03所属平台：学报论文发表咨询网浏览：次

　　摘要CRISPR/Cas9是继ZFNs(Zincfingernucleases)和TALENs(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases)之后出现的新型基因组定点编辑技术，相较于前两代技术，具有简便、高效等特点。CRISPR/Cas9不仅是一种基础性研究工具，而且已经成为目前有用的分子育种工具之一，在作物遗传改良方面取得重要进展。综述了CRISPR/Cas9系统的结构、分类、作用机制及在作物品质改良、产量提升、抗性育种和雄性不育材料选育中的应用进展，并探讨了其存在的问题，展望了其应用前景。

　　关键词CRISPR/Cas9;基因组编辑;gRNA;作物;遗传育种

分子植物育种

　　近几十年，世界人口数量大幅增长，粮食产量供给不足成为当代人面临的一大问题2]。影响农作物产量的因素除了耕地面积外，还有自然环境，包括非生物胁迫(干旱、高盐、低温、高温等)和生物胁迫(真菌、细菌、病害、虫害等)，其中病害导致农作物产量下降10%～15%[3]。

　　农业论文投稿刊物：《分子植物育种》“立足国内，面向国际”，是一份为转基因育种、分子标记辅助育种及常规育种服务的国际化科学杂志。也是中国唯一的一份以育种为名的科学杂志。围绕水稻、小麦、玉米、油菜、大豆、棉麻、薯类、果树、蔬菜、花卉、茶叶、林草等，刊登分子遗传育种理论、分子育种方法、分子育种研究动态以及优良种质培育等方面的科学论文报道。本刊按国际标准编排，题目摘要、图表和引用文献等均实行中英文对照。

　　CRISPR/Cas9(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromic repeats/CRISRPassociatednuclease9)技术是近几年发展起来的第代基因组编辑技术，它是一种能够研究基因功能并且提高作物产量的手段[45]，从在植物上第一次应用至今已有9a时间，研究人员利用该技术在植物领域进行了大量研究工作。目前，基因组编辑技术共出现了代。第代基因组编辑技术ZFNs(Zincfingernucleases)[68]，优点是可与细胞内DNA修复机制共同发挥作用，使研究者自如地编辑基因组，具有高度特异性，因而避免了免疫应答;缺点是需要组装复杂的蛋白质序列，导致构建难度较大，并且容易发生脱靶现象和易导致细胞死亡。

　　第代基因组编辑技术TALENs(Transcriptionactivatorlikeeffectornucleases)[912]，优点是在很大程度上避免了脱靶现象，构建复杂蛋白质序列时较第一代技术简单，缺点是该技术易受环境影响。第代基因组编辑技术CRISPR/Cas9，与前代技术相比，优点是仅需设计和构建几十个碱基的CRISPRRNA序列即可，用时更少且简便、突变效率高;缺点是易发生脱靶现象，而且靶突变验证难度高，目前该技术已被应用于多种生物的基因组定向编辑[1316]。综述了CRISPR/Cas9系统的结构、分类、作用机制及在作物遗传改良中的应用进展，并探讨了存在的问题，展望了其应用前景。

　　1CRISPR/Cas系统介绍1.1CRISPR/Cas9系统的发展史

　　20世纪80年代末，日本科学家ISHINO发现大肠杆菌基因组中碱性磷酸酶同工酶基因IAP上游存在一系列间隔的重复序列17。研究人员对大肠杆菌进行基因组测序，发现许多具有单拷贝的前导序列和多拷贝的短序列。随后，有更多的相似位点在细菌和古菌中被测出18。多位科学家认为，该结构能在DNA修复和基因调控中起作用19。2002年，JANSEN等[2在细菌与古细菌中发现了新的重复序列家族，该重复序列结构特点为25～37bp的序列片段与非重复的间隔序列交替出现，因为核苷酸序列与片段大小在同一物种内高度保守，种间则无相似性，JANSEN依照此结构将其命名为成簇的规律性间隔短回文重复序列，即CRISPR。

　　2005年，BOLOTIN[2发现，CRISPR中的这些短序列来自病毒和质粒，对CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白结构进行分析，发现其具有核酸酶和解旋酶活性[2。随后人们通过研究发现，CRISPR/Cas系统应该是存在于细菌和古细菌中的一种适应性免疫系统25。

　　2007年，BARRANGOU等26通过对嗜热链球菌进行试验进一步证实了CRISPR/Cas系统的适应性免疫过程，噬菌体侵染细菌后，细菌会从噬菌体基因组中将一段序列整合进自身基因组成为新的间隔序列，形成了特异性抵抗噬菌体的表型。2012年，成熟的crRNA(CRISPRRNA)被鉴定为与Cas蛋白相关的引导序列，有助于细菌对外源DNA的抵抗27。201年，CONG等28使用人工设计的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统成功诱导人和小鼠基因组的靶向切割，证实了RNA引导的CRISPR/Cas9技术具有广泛适应性。ANDRIY等29利用CRISPR/Cas9技术在双RNA复合物的引导下成功对肺炎双球菌和大肠杆菌基因组进行定点突变，证明了该技术能在细菌基因组中进行编辑的可行性。

　　1.2CRISPR/Cas系统的分类

　　CRISPR/Cas系统中Cas核酸酶能够通过引导RNA(uideRNA，gRNA)的协助定点编辑基因组DNA。Cas蛋白作为一种核酸酶能够在gRNA与外源DNA序列互补后定点切割外源基因序列。多项研究结果发现，CRISPR/Cas系统的成熟是通过产生种类不同的Cas蛋白来实现的[3。MAKAROVA等[3根据Cas蛋白的类别将CRISPR/Cas系统划分为种类型。Ⅰ型系统包括个Cas蛋白，其中以Cas3蛋白为标志性蛋白。Cas3蛋白包含SF2(Superfamily2)解旋酶结构域和HDHistidinespartatedomain)核酸酶结构域，成为主要功能蛋白，能促进crRNA的合成，同时能在系统靶向干扰期间行使功能32。

　　相较于其他个类型，Ⅰ型系统Cas蛋白在数量和复杂程度上位居第一。SINKUNAS等33以嗜热链球菌为材料，发现Cas3蛋白能够凭借其HD结构域优先选择单链DNA为作用底物。另外，Cas3蛋白HD结构域的核酸酶活性是非ATP依赖性的，在对外源DNA切割时具有促进作用。Ⅱ型CRISPR/Cas系统以Cas9蛋白为主34。Cas9蛋白参与crRNA的合成35，含有HNH(Histineasparaginehistine)核酸酶结构域和RuvC(Crossoverjunctionendodeoxyribonuclease)结构域，能够有效降解外源DNA和质粒。HNH核酸酶结构域能够特异性切割外源DNA与间隔序列的互补链，RuvC结构域能够切割另一条链3637。

　　Ⅲ型CRISPR/Cas系统主要存在于古细菌中，大多数在临床分离的致病菌中被发现，该系统以Cas10蛋白为标志性蛋白，对crRNA成熟起促进作用。种类型系统各有特点，其中Ⅱ型CRISPR/Cas9系统因为仅需Cas9蛋白即可起到使外源DNA双链断裂的作用，而且只需要gRNA引导即可发挥功能，反观Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统需要复杂的蛋白复合物和多个RNA协助起作用。目前，CRISPR/Cas9系统已被人们改良并应用于多种生物基因组编辑38。

　　2CRISPR/Cas9技术在作物遗传育种中的应用进展

　　植物为人们提供食物、动物饲料、药品、化学品、可再生材料和生物燃料。人们通过对植物进行培育来获得人们需要的优良性状。常规育种方法依靠现有的自然遗传变异，需要进行长期选育过程，才能将选定的性状渗入到另一个优良的品种中，且选育效果受到自然界中优良等位基因的可用性限制。新的等位基因可以通过随机诱变引入，但具有理想特性的突变体必须对大种群进行耗时的筛选才能确定。因此，可以通过直接引入精确和可预测的基因组修饰来加速植物育种，而CRISPR/Cas9系统功能完备，且可以同时对多个靶位点进行修饰。

　　3CRISPR/Cas9技术存在的问题及前景

　　在过去的几年里CRISPR/Cas9基因组编辑技术已经取得了很大的进步，但该技术仍存在一些未完全解决的问题，如脱靶现象、外源基因残留等。

　　3.1脱靶问题

　　与ZFNs和TALENs基因组编辑技术相比，依赖于gRNA的CRISPR/Cas9技术在特异性识别方面更具有优势，但由于其编辑对象的基因组碱基数目庞大，相似片段也会广泛存在，gRNA可能会识别靶点DNA以外的相似片段，也就会导致Cas9核酸酶对基因组的错误切割，引发脱靶现象。这种非特异性的基因组编辑易对编辑对象的生物学反应造成不确定性，影响该技术在研究和实践中的可靠性。

　　3.2外源基因残留问题

　　从CRISPR/Cas9技术开发至今，针对植物基因组编辑的常规方法是构建含有gRNA和Cas蛋白基因序列的载体，然后通过农杆菌介导等方法转入受体，获得基因组编辑突变植株，之后可经过杂交或自交等方法剔除多余的外源基因。但质粒在降解过程中可能会有未完全降解的小片段留在植物体内，导致外源基因残留。目前，研究人员针对脱靶现象不断改进该技术，使其降低脱靶率，解决外源基因残留的问题。由于CRISPR/Cas9技术具有简单、高效等优势，所以该技术依然具有广泛应用于多种生物基因组编辑的前景。

　　CRISPR/Cas9系统虽然是一个非常好的基因组编辑工具，但需要更详细地研究脱靶突变的程度，以及不同但完全匹配的靶点之间的切割效率差异。研究人员同时生产并测试多种gRNAs的能力并且大力发展新一代测序技术，这将为比较CRISPR/Cas9技术在多个物种和不同细胞类型中的应用效果提供充足的依据。此外，Cas9蛋白的结构分析及其与gRNA和目标DNA的相互作用将促进更高效和特异性的新型核酸酶的开发。

　　通过对Cas蛋白的深入研究，研究人员开发出需要更长PAM的Cas9蛋白(更长的PAM在基因组中出现率更低)，这可能会进一步减少脱靶效应。每一个涉及宿主病原体相互作用的进化过程都是一场通过适应对手并产生新的对抗机制来战胜对手的军备竞赛。因此，一些病毒很可能已经进化出了能够抵抗细菌免疫系统的调控因子，而这些尚未被发现的调控因子可能对病毒抵抗细菌CRISPR/Cas9系统提供帮助。

　　参考文献：

　　[1]SUWEISS,CARRJA,MARITANA,etal.Resilienceandreactivityofglobalfoodsecurity[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,2015,112(22):60926097.

　　[2]CHESEMANJ.Foodecurityintheaceofalinity,rought,limatehange,andopulationrowth[M].HalophytesforFoodSecurityinDryLands.2016.111–123.

　　[3]WUQH,ZHANGSX,FENGG,etal.DeterminingtheoptimumrangeofsoilOlsenPforhighPuseefficiency,cropyield,andsoilfertilityinthreetypicalcroplandsoils[J].Pedosphere,2020,30(06):832843.

　　[4]LIUH,DINGY,ZHOUY,etal.CRISPRP2.0:animprovedCRISPRCas9toolforgenomeeditinginplants[J].MolecularPlant,2017,10(3):530533.

　　作者：焦耀磊，王春生，曲硕，孙珊珊，朱婷婷，赵贺，王丕武

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