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发布时间：2021-11-25 17:26所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘要：通过单因素实验探究超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数对红枣多酚得率的影响。在此基础上，采用遗传算法优化超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺，并采用高效液相色谱分析酚类物质组成。结果表明，超声-复合酶辅助提取红枣多酚最优的工艺参数为：超声
摘要：通过单因素实验探究超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数对红枣多酚得率的影响。在此基础上，采用遗传算法优化超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺，并采用高效液相色谱分析酚类物质组成。结果表明，超声-复合酶辅助提取红枣多酚最优的工艺参数为：超声功率200W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%。在此条件下，所得红枣多酚得率为(0.94±0.008)%。实验值和理论值的相对误差为3.29%。表明遗传算法优化红枣多酚提取工艺参数是可行的。经鉴定发现红枣中含有没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素8中酚类物质。研究结果为红枣多酚开发提供重要的参考依据。
关键词：超声-复合酶辅助提取;红枣;多酚;工艺;组分
红枣是鼠李科(Rhamnaceae)枣属植物枣树(ZiziphusjujubaMill.)的成熟果实，在我国有着悠久的种植历史。红枣中含有多酚、多糖、皂苷、色素、抗氧化酶和各种维生素等活性成分[1]。研究表明，红枣多酚具有较强的抗氧化活性，同时具有抗炎、抗肿瘤和保护心脑血管等功效[2]。
红枣多酚提取是红枣作为功能性食品关键环节之一。目前多酚提取以溶剂提取为主，但该方式提取效率低、溶剂消耗量大、易造成环境污染[3]，该方式已经不能满足当前红枣产业快速发展的需求。超声作为一种新型的物理提取技术，该方式利用超声所产生的“机械效应”和“空化效应”，破坏植物细胞壁，降低多酚由内向外的扩散阻力，提高扩散系数[4]。
因此，该技术被广泛应用于花色苷[5]、黄酮[6]和多糖[7]等活性成分的提取。红枣细胞壁主要成分为纤维素、半纤维素和果胶。因此，利用纤维素酶和果胶酶等相关酶类可降解红枣细胞壁，同样也可以降低红枣多酚的扩散阻力，达到提高多酚得率的目的[8]。目前，采用超声-复合酶辅助提取红枣多酚的研究未见报道。除提取技术外，红枣多酚得率还取决于溶剂性质、萃取温度和超声功率等提取参数。
因此，优化红枣多酚的提取条件是提高红枣多酚得率的关键。遗传算法(Geneticalgorithms，GA)可以进行反复迭代，使其无限趋于真值，预测和优化误差均较小。因此，该方法比较适用于多因素提取工艺优化。但采用该方法对红枣多酚的提取条件进行优化的研究鲜见报道。本研究采用超声-复合酶酶辅助提取技术对红枣多酚进行提取，探究超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数对红枣多酚得率的影响，并通过GA优化其提取工艺;采用高效液相色谱(Highperformanceliquidchromatography，HPLC)酚类物质组成。
1材料与方法
1.1材料与试剂
红枣：北京好想你红枣销售有限公司;果胶酶(2300U/g)：河北冠朗生物科技有限公司;纤维素酶(2000U/g)：上海联硕生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(2300U/g)：宝鸡市国康生物科技有限公司;无水乙醇(分析纯)和甲醇(色谱纯)：常州市启迪化工有限公司;碳酸钠和石油醚：河北言希化工有限公司;福林酚试剂：南通华汇化工有限公司;HP-20大孔吸附树脂：南京帕尔斯生物科技有限公司;没食子酸、咖啡酸、芦丁、原儿茶酸、绿原酸、肉桂酸、阿魏酸和槲皮素标准品(≥98%)：上海澄绍生物科技有限公司。
1.2仪器与设备
YM-1000CT超声波提取仪：上海豫明仪器有限公司;FZG真空冷冻干燥机：常州市东南干燥设备有限公司;754N紫外可见分光光度计：南京晓晓仪器设备有限公司;KH19A高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司;Breezel1525高效液相色谱仪：美国Waters公司;RE-52AA型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂;DK-98-IIA型恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司。
1.3实验方法
1.3.1样品前处理
将新鲜的红枣用清水冲洗，自然晾干，用刀子剔除枣核，然后置于真空冷冻干燥机中干燥直到红枣含水率低于5%为止。采用植物粉碎机将其粉碎，过40目筛，即制得红枣粉末。将其密封避光保存在4℃冰箱中备用。
1.3.2超声-复合酶辅助提取红枣多酚
称取5.0g红枣粉末于具塞三角瓶中，按照料液比1∶30g/mL的比例加入不同体积分数的乙醇溶液，使其充分混合，加入不同质量比组成的复合酶(纤维素酶∶果胶酶∶木瓜蛋白酶=1∶1∶1，g/g/g)，将其置于超声波提取仪中，设定超声时间30min，待提取结束后，将提取物离心(7000r/min，15min)，过滤获得滤液，残渣重复3次上述操作，合并滤液，滤液在40℃旋转蒸发仪减压浓缩，真空冷冻干燥，制得红枣多酚提取物(Jujubetpolyphenolextract，JPE)。
1.3.3红枣多酚得率测定
没食子酸标准曲线的绘制：准确称量0.25g没食子酸标准品，采用蒸馏水将其溶解，并定容在50mL容量瓶中，从中取出1mL将其定容100mL，得到50μg/mL标准液。分别从中取出0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，加入2mL福林酚试剂，混合均匀，然后加入2.5mL质量分数Na2CO3溶液，反应30s，用蒸馏水作对照，在765nm测定吸光度，以样品浓度作为横坐标(C)，吸光度纵坐标(A)，对数据进行回归分析，得到标准方式为：A=0.1326C+0.00783，相关系数R2=0.9993。
1.3.4单因素实验
选择超声-复合酶辅助提取法作为红枣多酚的提取方法，操作同1.3.2。以5g红枣粉末为提取对象，对超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体积分数4个因素进行单因素实验，讨论上述4个因素对红枣多酚得率的影响。超声功率为100、150、200*、250和300W5个水平;复合酶添加量为0.10%、0.15%、0.20%*、0.25%和0.30%5个水平;提取温度为30、40、50*、60和70℃5个水平;乙醇体积分数为40%、50%、60%*、70%和80%5个水平。每组实验重复3次，结果用平均值±标准差表示。(注：*标记的因素保持恒定水平。)
1.3.5响应面法(Responsesurfacemethod，RSM)实验
组合实验是在单因素实验的基础上进行，本研究选取自变量分别为超声功率(X1)、提取温度(X2)、乙醇体积分数(X3)和果胶酶剂量(X4)，响应值为多酚得率(Y)。根据Design-Expert8.0.6中的Box-Behnken设计组合实验。
1.3.6遗传算法设计
GA是一种随机非线性优化算法，具有无限迭代的特点，使其预测和优化值无限趋于真值。利用RSM模型作为GA的适应度函数，对红枣多酚的提取工艺进行优化。优化过程中选择随机均匀函数和分散交叉函数，采用MatlabR2018b对超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺进行优化。
1.3.7红枣多酚纯化
采用40%乙醇溶液溶解在最优提取工艺下获得的JPE，然后将其定容至500mL容量瓶中作为样品溶液备用。从中取出400mL加入到预处理的HP-20大孔树脂柱中，用缓冲液将样品pH调至5～6，待吸附平衡后。采用体积分数70%乙醇溶液进行洗脱，洗脱流速为2.0mL/min，收集洗脱液，洗脱液先置于40℃旋转蒸发仪减压浓缩，然后将浓缩液置于真空冷冻干燥机中冻干，制得红枣多酚纯化物。
1.3.8红枣多酚组分分析
标准曲线绘制：分别准确称取1mg没食子酸、咖啡酸、芦丁、原儿茶酸、绿原酸、肉桂酸、阿魏酸和槲皮素标准品，用甲醇将其溶解，分别配制不同质量浓度的标准溶液。
上述溶液分别过0.45μm滤膜，用于HPLC分析，利用峰面积作为纵坐标，标注品浓度作为横坐标，将两者进行线性回归，绘制每个标准品的标准方程。样品前处理：准确称取1mgJPE，用甲醇溶解，过0.45μm滤膜，用于HPLC分析。色谱条件：柱温和流速分别为20℃和0.8mL/min;进样量和检测波长分别为20μL和280nm;流动相A和B分别为体积分数5%甲醇溶液(含体积分数0.1%三氟乙酸)和色谱甲醇。洗脱条件：0～5min，0%B;5～15min，30%B;15～25min，30%B;25～40min，65%B;40～60min，100%B。
2结果与分析
2.1单因素对红枣多酚得率的影响
当超声功率在100～250W范围内，随超声功率增加红枣多酚得率呈显著增加趋势(P<0.05)。其原因是随超声功率增加，超声所产生的“空化效应”和“机械效应”加速红枣细胞壁破裂，降低多酚由内向外的传质阻力，同时扩散系数增加，有利于多酚从细胞内扩散到提取溶剂中，增加多酚得率[10]。该方式提取所得的多酚得率明显高于李霄等[11]采用超声波提取陕北红枣多酚的得率。当超声功率超过250W，多酚得率随超声功率增加呈显著降低的趋势(P<0.05)。其原因是大的超声功率可能会破坏多酚结构，同时增加杂质溶解度，造成多酚得率降低[12]。
综合考虑，本实验选择超声功率为200、250和300W三个水平进行后续组合实验。当复合酶添加量在0.10%～0.20%范围内，随复合酶添加量增加多酚得率呈现显著增加的趋势(P<0.05)。当复合酶添加量在0.20%时，多酚得率取得最大值(0.75±0.007)%。其原因是随复合酶添加量增加，复合酶催化红枣细胞壁发生降解，降低多酚由内向外的传递阻力，有利于多酚的提取[13]。
在超声辅助作用下，采用复合酶提取红枣多酚得率高于Woo等[14]采用单一酶提取红枣多酚的得率。此外，对比张瑞妮[9]采用超声提取所得的红枣多酚得率发现，利用超声-复合酶辅助提取红枣多酚得率明显高于超声提取。但当复合酶添加量超过0.20%时，多酚得率随复合酶添加量呈显著降低的趋势(P<0.05)。其原因是复合酶添加量增加也有利于杂质的溶解，从而降低多酚的溶解度，不利于多酚的提取[15]。综合考虑，复合酶添加量选择0.15%、0.20%和0.25%三个水平进行后续的组合实验。
2.2.2红枣多酚提取工艺参数优化
采用MatlabR2018b对提取工艺进行优化，当运算迭代90次，红枣多酚得率取得最大值，此时实验因素(超声功率、复合酶添加量、提取温度和乙醇体 积分数)编码分别为-0.999、-1、1、-1，对应的因素水平分别为21.01%、22.36%、405.7W和1∶21.875g/mL，此时，所得红枣多酚得率的理论值为0.91%。
2.2.3实验验证
采用遗传算法优化超声-复合酶提取红枣多酚得率工艺参数为：超声功率200.05W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%，所得红枣多酚得率的理论值为0.91%。为验证遗传算法的可靠性，对工艺参数修正为：超声功率200W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%。按照上述因素水平进行三次重复实验，所得红枣多酚得率为(0.94±0.008)%，实验值和理论值的相对误差为3.29%。说明遗传算法可较好地模拟和预测红枣多酚得率。
2.3红枣多酚组分分析
2.3.1标准曲线及其回归方程8种标准曲线回归方程和HPLC分析。8种标准 品的回归方程相关性系数(R2)均在0.99以上。结果表明，采用峰面积定量分析红枣多酚组成是可行的。
2.3.2红枣多酚主要成分分析
红枣多酚初步纯化液的HPLC。通过对比标准品HPLC可知确定红枣多酚纯化物中含有8种多酚类物质，分别为没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素。通过标准品所对应的方程对红枣多酚纯化物中的酚类成分进行定量，可得没食子酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸、芦丁、肉桂酸和槲皮素含量分别为0.725、0.462、0.125、0.351、0.302、0.268、0.570和0.283mg/g。通过数据分析发现红枣多酚主要酚类物质为没食子酸和肉桂酸。
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3结论
本研究通过遗传算法优化超声-复合酶辅助提取红枣多酚工艺，得到最优工艺参数为：超声功率200W、复合酶添加量0.15%、提取温度50℃和乙醇体积分数50%。在此条件下，所得红枣多酚得率为(0.94±0.008)%。在最优工艺下获得的红枣多酚纯化物含有8种多酚类物质，其中没食子酸和肉桂酸为主要的酚类物质。
参考文献：
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[6]UpadhyayR，NachiappanG，MishraHN.UltrasoundassistedextractionofflavonoidsandphenoliccompoundsfromOcimumtenuiflorumleaves[J].FoodScienceandBiotechnology，2015，24(6)：1951-1958.
作者：徐迎涛，吴君
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《遗传算法优化超声复合酶辅助提取红枣多酚工艺及其组分分析》