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发布时间：2022-04-22 11:06所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘 要：从海洋中筛选高效降解亚硝酸盐的低温细菌，以降低食品及环境中亚硝酸盐存在的潜在危害。利用降解亚硝酸盐菌株的产酸、氧化或还原特性，分别使用含有 0.01% 亚甲基蓝(蓝板)和 1% CaCO3(白板)的两种鉴别培养基，对海洋样品进行筛选分离，共得到 30 株菌，均具
摘 要：从海洋中筛选高效降解亚硝酸盐的低温细菌，以降低食品及环境中亚硝酸盐存在的潜在危害。利用降解亚硝酸盐菌株的产酸、氧化或还原特性，分别使用含有 0.01% 亚甲基蓝(蓝板)和 1% CaCO3(白板)的两种鉴别培养基，对海洋样品进行筛选分离，共得到 30 株菌，均具有降解亚硝酸盐能力，降解率在91% ～ 99.7% 之间;其中菌株“8”对亚硝酸盐降解率高达 99.7%，作用环境 pH 为 3.98，经 16S rDNA 基因序列比对和系统发育树分析鉴定为蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus.)。本实验首次使用含亚甲基蓝成分的培养基作为氧化或还原反应降解亚硝酸盐菌的筛选培养基，筛选效率高;而含 CaCO3 的培养基可作为以产酸性物质降解亚硝酸盐菌的筛选培养基。试验所采用的策略，降低了筛选成本和时间，大大提高了效率，且筛选得到的细菌对亚硝酸盐具有高降解率，有极大的应用潜力。
关键词：海洋细菌;培养基;亚硝酸盐降解
亚硝酸盐是自然界中最普遍的含氮化合物，广泛存在于工业废水、化肥、染料及缓蚀剂中。亚硝酸盐作为食品添加剂在农业、工业、食品等方面大量使用，如在肉制品中可抑制肉毒杆菌等微生物的生长，有助于肉制品保持颜色并防止其腐烂，但膳食摄入过量亚硝酸盐会造成中毒甚至致癌，同时因其还会和其他物质反应导致胎儿畸形、动物及人的抑郁等，对环境和人类的安全有着极为严重的影响[1-4]。
因此，降解亚硝酸盐不仅在人类健康、延长寿命等方面有着重大的意义，对解决环境污染、解毒等方面同样意义重大。目前，降解亚硝酸盐的方法主要有物理法、化学法、生物法及酶处理法等，其中生物法因具有高效率、低成本、无二次污染等特点，得到广泛应用[5]。
亚硝酸盐降解菌能将环境中的亚硝酸盐氧化为硝酸盐，改善环境污染问题，降低水体中亚硝酸盐含量，从而缓解亚硝酸盐积累对水生生物造成的生存压力，进而降低对人体健康的潜在威胁[6-7]。海洋约占地球表面的 71%，是最大的生物储藏库，同时也是地球上最为丰富的资源库，近年来在海洋中发现的新物种更是超过 100 多种，为生命科学的研究提供了丰富的资源[8-10]。海洋营养成分中离不开氮，氮元素是生命体合成核酸和蛋白质等关键细胞化合物不可缺少的必要元素，在生物学上具有高度多样的可利用性[8]。
在大约 27 亿年前，微生物代谢活动逐渐进化成为控制与调节地球氮循环的主要驱动力，而亚硝酸盐是许多氮循环转化的中间体，作为许多生物用于生产能量的底物，因此 NO2- 在海水中的浓度极小[11-12]。据报道，亚硝酸盐的存在仅限于海洋中的特定深度和区域[13]。亚硝酸盐氧化是产生硝酸盐的主要途径，硝酸盐是生物可利用氮的主要形式，往往是限制表层海洋生物生产的营养物质。然而，表层以下硝酸盐的普遍存在证明了海洋内部亚硝酸盐氧化的大量发生，亚硝酸盐氧化是向表层海洋再补给氮的关键通道，因此对全球氮循环至关重要[14]。
海洋中的氮处于不断转化和循环过程中，此过程受到了化学、生物和物理等各因素的影响。其中生物因素主要依赖于生物作用，由亚硝酸盐氧化细菌(NOB)氧化亚硝酸盐产生的硝酸盐约占海洋固定氮的 90%，因此，NOB 是全球氮循环的重要贡献者，不仅是海洋环境中硝酸盐的主要生物来源，而且在海洋生态系统的物质和能量代谢中发挥重要的生态功能，从而进一步推动了海洋亚硝酸盐氧化过程的研究[15-16]。虽然目前已报道了多种能降解亚硝酸盐的细菌，但菌种类群不多，又因实验技术本身的限制，即使选择多种不同的培养基和分离条件，也仅能分离出少量优势菌群[17]。据资料显示，亚硝酸盐降解菌的筛选大多选用传统的微生物分离筛选方法，且使用传统的 MRS 分离培养基[18-19]，筛选方式费时。
同时，目前关于海洋中亚硝酸盐氧化菌的研究报道较少。因此，本研究采集多种海洋样品，分别使用含 CaCO3 及含亚甲基蓝的 2 种鉴别培养基，先筛选出具有特定功能的菌株，经白板长出的菌落周围可形成大小不一透明圈，其原理是白板中 CaCO3 含量较高，菌株能产生酸性物质，使 CaCO3 溶解，从而能筛选出产酸性物质的微生物，而酸性物质可使亚硝酸盐降解。经蓝板长出的菌落周围可产生大小不一的脱色圈，其原理是此菌能产生氧化性物质或还原性物质，使亚甲基蓝氧化或还原，而亚甲基蓝同亚硝酸盐一样无论是被氧化或还原都能消耗，因此能筛选出产生氧化性物质或还原性物质的微生物。在一定程度上可降低筛选成本和时间，大大提高筛选效率。
进一步测定菌株对亚硝酸盐降解能力、硝酸盐还原能力及降解过程中环境 pH 的变化，最后挑选降解能力最强的菌进行 16S rDNA 鉴定。以期为食品添加剂亚硝酸盐残留的进一步降解、海洋中降解亚硝酸盐菌群资源的挖掘及应用、食品安全问题及环境污染问题等方面的研究奠定一定的基础，同时为海洋菌株的研究、开发的研究利用提供一定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品来源从大连丽娇湾、大连金石滩、大连老虎滩等海域采集获得 8 种海泥样品，海藻、海虹、海带、贝壳、螃蟹、海蛎子、皮皮虾等 7 种浅海动植物，7 种海鱼(黄花鱼、海昌鱼等)等样品。采集后放入 -20℃冰箱备用。
1.1.2 培养基① CaCO3 培养基：葡萄糖 60g、蛋白胨 3g、CaCO3 10g、NaNO3 4g、KH2PO4 2g、MgSO40.7g、KCl 0.5g、脱氧胆酸钠 0.2g、可溶性淀粉10g、KI 1.7g、琼脂 20g，海水定容至 1000mL，pH5.6，1×105Pa 灭菌 20min;②亚甲基蓝培养基：葡萄糖 20g、蛋白胨 20g、酵母粉 10g、亚甲基蓝 0.1g、琼脂 20g，海水定容至 1000mL，pH5.6，1×105Pa 灭 菌 20min。
③ 2216E 固体培养基：磷酸高铁 1g、蛋白胨 10g、亚甲基蓝 0.1g、牛肉膏 3g、葡萄糖 60g、琼脂 20g、海水 500mL、单蒸水 500mL、pH7.6，0.1MPa，1×105Pa 灭 菌20min;④ LB 固体培养基;⑤ LB 液体培养基;⑥亚硝酸盐液体培养基：葡萄糖 60g、蛋白胨10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、NaNO2 0.2g，蒸馏水定容至 1000mL，pH 7.0，1×105Pa 灭菌 20min;⑦硝酸盐液体培养基：葡萄糖 60g、蛋白胨 10g、酵母粉 5g、NaCl 10g、NaNO3 0.2g，蒸馏水定容至 1000mL，pH 7.0，1×105Pa 灭菌 20min。
1.2 方法
1.2.1 菌株筛选制备
样品涂布液：取浅海的海藻、海虹、海带、贝壳、螃蟹、海蛎子、皮皮虾等 7 种样品，8 种海泥样品，7 种海鱼样品，各称取 10g 研磨(带壳的样品洗净榨碎后称取)，放入盛有 90mL无菌海水带有玻璃珠的三角瓶中，震摇约 20min。用 1mL 无菌吸管取 1mL 液体，加入盛有 99mL无菌海水的锥形瓶中混匀，依次释为 10-1、10-3、10-5、10-7 四个稀释梯度的菌悬液。
涂平板、培养：把由 7 种海洋动植物、8 个海泥样品等得到的 10-1、10-3、10-5、10-7 的菌悬液分别涂平板。其中，浅海样品取 0.1mL 菌液涂布到 CaCO3 培养基和亚甲基蓝培养基两种平板上，每个梯度涂 5 个平板，于 20℃倒置培养，海鱼样品取 0.1mL 菌液涂布到 2216E 固体培养基、CaCO3 培养基的平板上，每个梯度涂 5 个平板，于 20℃倒置培养。
共培养 10d，1 ～ 5d 每 24h 观察一次，5 ～ 10d 每 12h 观察一次，并进行记录。挑选在 20℃下生长良好的菌落进行下一步实验。菌落观察、统计：将 7 个浅海动植物样品、7个海鱼样品、8 个海泥样品培养得到的平板进行肉眼菌落形态观察及显微菌体形态观察，统计菌落种类。同时选出产生透明圈或有颜色反应(培养基蓝色褪去或变浅)的平板。用点种法与平板划线法相结合，对选出的菌落进行分离纯化、保藏。
1.2.2 理化指标测定
亚硝酸盐测定：亚硝酸盐含量的测定采用盐酸萘乙二胺法[20]。将筛选出的菌株先分别接入装有 100mL 亚硝酸盐液体培养基的三角瓶中培养48h，然后按 5% 比例低温接种在 100mL 含亚硝酸盐液体培养基中培养 48h，取 5mL 样品，放入250mL 三角瓶，再加入 5mL 亚铁氰化钾和 5mL乙酸锌，加水定容至 250mL。待其沉淀 30min后，过滤出 40mL 菌液，再加入对氨基苯磺酸2mL 和盐酸奈乙二胺 1mL，定容至 50mL。观察颜色变化，同时在波长 538nm 处测定吸光值。为了测出菌液浓度，在 638nm 处测 OD 值。
每个样品三组平行。降解率计算方法如下：降解率(%)=((空白对照 NO2- 含量 - 样品NO2- 含量)/ 空白对照 NO2- 含量)×100%硝酸盐测定：挑取获得的菌株在 100mL 分装好的硝酸盐液体培养基中培养 48h，按 5% 比例转接入装有 100mL 硝酸盐液体培养基的三角瓶中，培养 48h 后取 5mL 菌液，加入 5mL 缓冲液，30mL 蒸 馏 水，0.1g 活 性 炭， 水 浴 摇 匀， 静 置20min，观察结果时，在试管中加入几滴 Griess试剂，若出现红色，则说明具备硝酸盐还原性，每 2h 观察颜色变化。每个样品三组平行。
pH 测定：将筛选出的菌株先接入各装有100mL 亚硝酸盐液体培养基的三角瓶中培养 48h，按 5% 比例接入装有 100mL 亚硝酸盐液体培养基的三角瓶中，培养 48h 后用酸度计测定 pH。每个样品三组平行，以不接菌亚硝酸盐液体培养液作为空白对照。
1.2.3 DNA 的提取
通过化学与酶法相结合即 SDS 结合蛋白酶 K法[21]提取样品基因组 DNA。向样品中加入 DNA提取液与蛋白酶 K，在 37℃，225r/min 条件下振荡 30min;加入 SDS，65℃水浴 2h，每隔 15min颠倒混匀;12000g，4℃条件下离心 10min;取上清液抽提 2 次，12000g，4℃条件下离心 20min;弃上清，沉淀中加入预冷的 70% 乙醇，12000g，4℃条件下离心 10min;风干，溶于无菌水。
1.2.4 菌株分子生物学鉴定
将目的菌株活化后提取总 DNA，以此为模 板， 用 16SrDNA 通用引物 27F/1492R 进 行PCR 扩 增，PCR 反应采用 50μL 体 系。 反 应 条件：94℃，5min;94℃，45s;55℃，45s;72℃，2min，30 个循环;72℃，10min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳切胶回收后交由宝生物工程(大连)有限公司测序。所得菌株的基因序列在 NCBI 数据库中进行比对，从中获得与菌株 16SrDNA 同源的序列，利用 MEGA5.0 软件构建系统发育树。
2 结果与分析
2.1 细菌初筛对海泥、浅海动植物、海鱼样品分别稀释不同梯度，涂平板、于 20℃倒置培养 10 d，通过肉眼观察菌落特征。根据菌株产酸特性，观察到能使 CaCO3 溶解的产酸菌落(透明圈)：经白板长出的菌落周围可形成大小不一透明圈，其原理是白板中 CaCO3 含量较高，菌株产生酸性物质使 CaCO3 溶解，从而能筛选出产酸性物质的微生物，而酸性物质可使亚硝酸盐降解。
经蓝板长出的菌落周围可产生大小不一的脱色圈，其原理是此菌能产生氧化性物质或还原性物质，使亚甲基蓝氧化或还原，而亚甲基蓝同亚硝酸盐一样无论是被氧化或还原都能消耗，因此能筛选出产生氧化性物质或还原性物质的微生物。
此外亚甲基蓝也可同亚硝酸盐反应，临床上经常使用亚甲基蓝解毒亚硝酸盐。挑选能使亚甲基蓝蓝色减退，或能使 CaCO3产生透明圈的单菌落，进一步经点种法验证后对菌株进行纯化，显微镜形态观察，获得 30 株细菌。对这 30 株细菌进行 48h 试管液体活化后(每株菌接种 10 只试管，每管 10mL 液体培养基)，按 5% 比例转接入装有 10mL 液体培养基的试管内，20℃低温培养 48h，在 600nm 测定 OD值，筛选出菌液浑浊度相近的 30 株菌的试管。
根据以往的研究，环境 pH 在 4.5 ～ 6.5 时，环境中亚硝酸盐的降解率与环境的 pH 相关性不大;当环境 pH < 4.5，亚硝酸盐的降解量与环境pH 有显著的正相关;pH < 4.0 时，亚硝酸盐明显降解[22]。由表 3 可知，通过对 30 株细菌产酸能力进行研究，发现有 12 株培养液的 pH 在 4.5以上;有 18 株培养液的 pH 在 4.5 以下;其中培养液 pH 在 4.0 以下的有 2 株，代号为“8”和“3-6”，产酸能力最强。
因此有 12 株细菌对环境中亚硝酸盐的降解可能与其产生氧化还原物质有关;有 16 株细菌对环境中亚硝酸盐的降解可能既与其产生的酸性物质有关也可能与其产生氧化还原物质有关;有 2 株细菌对环境中亚硝酸盐的降解可能与其产生的酸性物质有关。
通过对亚硝酸盐降解率进行测定，菌株“8”对亚硝酸盐的降解率达 99.7%，对该菌株进行16S rDNA 基因序列比对和系统发育树分析。对菌株 8 在 NCBI 上进行 16S rDNA 基因序列比对和系统发育树分析。结果表明菌株 8 与登录号为 KU986648.1 的蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus.)聚为一支，同源性为 99%，结合其菌落和菌体形态，将其鉴定为蜡样芽胞杆菌，后续试验会对此菌相关性质进行进一步研究。
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3 结论
能否获得目的菌种，是影响实验成败的关键因素。传统筛选降解亚硝酸盐菌株的方法是将分离纯化后的菌株接种至含有亚硝酸盐的培养液中，定时测定培养液中亚硝酸盐的含量，此筛选方法在筛选大批量菌株方面费时、费力、成本较高、效率低下。
而本研究使用含亚甲基蓝的培养基和含 CaCO3 的培养基，对能降解亚硝酸盐细菌的筛选效率能够达 100%，既节约了实验经济成本，又极大的节约了时间，因此本实验所用的鉴别平板用于筛选降解亚硝酸盐的微生物的方法值得研究与推广，特别是在与人类食品安全相关潜在菌株的筛选方面。本次试验用于筛选降解亚硝酸盐的微生物的策略值得研究与推广，得到的菌株有极大的应用潜力，同时样品均来自海洋，可为海洋中菌群资源的研究、开发利用提供一定理论基础。
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作者：孙全敏 1，2，迟雪梅 1，2，马明昊 1，2，胡杨林 1，2，迟乃玉 1，2，张庆芳 1，2，*
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《一种筛选高效降解亚硝酸盐海洋低温细菌的方法》