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发布时间：2021-06-26 16:42所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘要苯丙氨酸解氢酶(Phenylalanineammonia-lyase，PAL)基因家族参与苯丙烷类代谢过程，通过调控植物抗病次生物质的合成在植物抗逆反应中发挥重要作用。为明确谷子PAL基因家族在逆境胁迫下的表达规律，该文利用生物信息学方法对谷子PAL基因家族进行鉴定和表达
摘要苯丙氨酸解氢酶(Phenylalanineammonia-lyase，PAL)基因家族参与苯丙烷类代谢过程，通过调控植物抗病次生物质的合成在植物抗逆反应中发挥重要作用。为明确谷子PAL基因家族在逆境胁迫下的表达规律，该文利用生物信息学方法对谷子PAL基因家族进行鉴定和表达分析。结果表明：谷子具有11个PAL基因，在进化树中可分为个亚家族，SiPAL7独自进化为一支。通过构建蛋白结构域发现PAL基因家族成员均含有保守的PAL结构域。启动子分析显示，PAL基因含有应答激素、逆境胁迫等多种因子的顺式作用元件，说明PAL基因广泛参与不同生物学调控过程。qRT-PCR结果显示，谷子PAL家族基因多为诱导型表达，不同光照条件下PAL基因表达量变化明显，不同基因具有不同响应模式，说明谷子PAL基因家族在参与光调节反应中发挥重要作用。谷子PAL基因高度保守，广泛响应不同非生物胁迫，具有表达特异性。该研究结果可为揭示PAL基因家族在调节谷子抗性及胁迫应答过程中的作用提供参考。
关键词谷子，PAL基因家族，生物信息学分析，蛋白结构，表达分析
苯丙氨酸解氢酶(PhenylalanineAmmonia-Lyase，PAL)是苯丙烷代谢途径中的关键酶，参与木质素及酚类化合物的合成过程，广泛存在于各种植物中(Fraser&Chapple,2011;盖江涛等，2016)。Koukol&Comm(1961)在大麦(Hordeumvulgare)中首次提取出PAL蛋白，后续马铃薯(Solanumtuberosum)(Joos&Hahl,1992)、烟草(Nicotianatabacum)(Reichertetal.,2009)等高等植物也相继分离纯化得到PAL蛋白。杨郁文等(2017)研究发现PAL多以同源四聚体形式存在于细胞质和叶绿体内，通过转录水平等多层次调控方式，在植物防御系统中发挥重要作用。启动子缺失实验表明，MYB转录因子可通过结合PAL启动子区段，进行转录水平调控(杨郁文等，2017)。PAL可通过调控HCA类酚类、类黄酮等产物的合成影响果实品质(张丽之等，2018)。
除此之外，PAL广泛参与植物响应病原菌侵染过程。杨会晓等(2019)研究表明PAL与香蕉抗病性密切相关，在枯萎病菌侵染过程中PAL高丰度表达。PAL活性的增加与苯丙烷类产物的产量提高密切相关，其活性水平随发育阶段、细胞和组织的分化、不同应激刺激而改变。Listeretal.(1996)首次发现PAL活性与苹果Maluspumila)果实类黄酮含量存在显著正相关。杨会晓等(2019)发现MaPAL在香蕉(Musanana)果实发育成熟过程高丰度表达，同时次级代谢物质在这一阶段也具有较高的表达效率。Olsenetal.(2008)研究发现拟南芥(Arabidopsisthaliana)AtPAL1和AtPAL2基因在氮胁迫和温度变化过程中高丰度表达，并伴随着类黄酮化合物的积累。
随着基因组学的发展，多种植物基因组测序相继完成，植物中PAL基因的功能也陆续得到研究。大豆(Glycinemax)PAL1-1、PAL2-1、PAL2-3在木质素合成过程中发挥重要作用(候鹏等，2016);ZmPAL10强烈响应纹枯病菌侵染玉米(Zeamays)过程(邓路长等，2019);VamPAL参与山葡萄(Vitisamurensis)花色苷的积累(陈蒙等，2018)。
基因组学的迅速发展标志着在分子水平上进行系统分析已成为当下生物学研究的主流趋势(王灿等，2020)。谷子(Setariaitalica)属年生禾本科作物，基因组小且为二倍体，具有抗旱性强、生育期短、产量高等特点，是挖掘作物抗旱基因和解读抗逆分子机制的重要作物(宋健等，2020)。谷子生育期内需水量较少，属环境友好型作物(宋健等，2019)，抗逆育种靶向基因资源的研究已成为谷子增收工作的重要环节(Nadeemetal.,2020)。
谷子基因组测序的完成为谷子研究搭建了数据基础，标志着谷子遗传研究已进入后基因组学时代(Bennetzenetal.,2012;Zhangetal.,2012)。PAL基因家族广泛存在于植物中，但关于谷子PAL基因家族的研究却鲜有报道。为明确谷子PAL基因家族在逆境胁迫过程中的作用机理，本研究利用生物信息学方法对谷子PAL基因家族进行鉴定，分析其结构特点及进化方式，并构建PAL家族基因在非生物胁迫下的表达模式，为谷子PAL基因家族的生物学功能研究提供参考。
1材料与方法
1.1材料供试谷子(Setariaitalica)品种为年生‘张杂谷号’，盆栽种植于河北北方学院农场，分别置与自然光、黑暗、红光、蓝光、远红光条件下照射24h，取幼嫩叶片，液氮速冻后，-80℃保存备用。
1.2谷子PAL基因的鉴定及蛋白序列分析利用Pfam数据库查找并下载PAL蛋白结构域的隐马模型文件(Pfam号码：00221)(Finnatal.,2008)，利用plantGenes基因组获取GenestableID及TranscriptstableID，通过CDD和InterProScan对Gramene网站获取的序列进行筛选鉴定，去除冗余，得到PAL蛋白序列、染色体定位等基因信息(Marchleretal.,2009;Hunteretal.,2009)。利用ProtParam数据库通过序列信息得到氨基酸数量、等电点等用于推测蛋白质的相关因子(宋健等，2020)。
1.3基因的染色体定位
通过MG2C在线工具，利用谷子PAL基因位置信息以及从EnsemblePlants查询到的谷子染色体长度，绘制PAL基因的染色体定位。
1.4谷子PAL
蛋白分析及进化树绘制使用ProSite和ClustalX在线软件对谷子PAL蛋白结构域位置进行序列对齐。通过MEGA6.0软件中的衔接法(neighbor-joining,NJ)采样泊松模型绘制蛋白进化树(bootstrap为1000)(Sigristetal.,2010;Larkinetal.,2007)。通过上述方法对二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、高粱(Sorghumbicolor)、狗尾草(Setariaviridis)等54个PAL家族成员绘制蛋白进化树(bootstrap为默认值)。
1.5Motif获取及蛋白预测
在MEME网站得到谷子PAL的motif模式(最小宽度设置为60，最大宽度设置为200)(Baileyetal.,2009)，利用Weblogo分析得出PAL结构域motif(StacksperLine设置为100)，最后在SWISS-MODEL网站中利用其各基因位点出现频率最高基因组成的保守序列预测其三维结构并得到螺旋模式(Kieferetal.,2009)，并根据上述方法对二穗短柄草、水稻等物种的PAL蛋白进行预测，分析对比各物种的蛋白结构差异。
1.6PAL同源共线性分析
在PAL系统发育的基础上，谷子和水稻(Oryzasativa)的直系同源片段已得到鉴定。利用EnsemblPlants网站的基因组比较功能得到谷子和水稻PAL同系物的同源共线图(Wangetal.,2012)。通过其染色体定位及基因位置，在AdobeIllustratorCS4软件绘制谷子和水稻PAL同源物的同源共线图，分析其共线性。
1.7PAL基因结构分析
通过Phytozome数据库获得谷子PAL基因的序列信息，使用GSDS2.0在线数据库分析其编码序列，得到内含子外显子结构模型(Huetal.,2015)。在谷子基因组数据库得到PAL起始密码子上游1500bp区域序列，利用plantCARE分析其顺式作用元件，通过GSDS2.0将其可视化(Lescotetal.,2002)。
2结果和分析
2.1谷子PAL基因家族鉴定
利用CDD和InterProScan软件对plantGenes63基因组获取的GenestableID及TranscriptstableID(PF号码为00221)检测鉴定，并检查缺失，去除冗余，获得谷子PAL基因序列。谷子中共鉴定11个PAL家族基因，分别命名为SiPAL1~SiPAL11。11个PAL蛋白序列差异较小：氨基酸长度为698aa(SiPAL1、SiPAL8)~891aa(SiPAL7)，开放阅读框长度2142bp(SiPAL3)~4610bp(SiPAL2)，分子质量为74.99kD(SiPAL8)~95.01kD(SiPAL7)，等电点为5.82(SiPAL5)~6.52(SiPAL6)，含有(SiPAL3、SiPAL4、SiPAL5)~6(SiPAL7)个外显子。
通过表发现位于号染色体的个基因(SiPAL1-SiPAL5)具有相似的编码蛋白特征，且基因位置紧密排列在一起，位于号染色体的个基因(SiPAL9-SiPAL11)虽然紧密排列，但其编码蛋白的特征却相差较大。所有PAL蛋白的等电点均在5.82~6.52之间，说明苯丙氨酸解氢酶具有酸性特征，PAL蛋白可能在弱酸性的环境中发挥作用。
PAL家族基因除SiPAL7外，外显子数量较小，推测10个PAL家族基因具有相似的功能。由PAL基因的染色体分布来看，号染色体有个紧密排列的PAL基因，分布的基因数量最多;号染色体具有个PAL基因且紧密排列，其他染色体上没有成簇PAL基因分布。还发现PAL基因不均匀分布在染色体各个部位，其中号染色体和号染色体PAL基因形成簇状分布。利用Phytozome数据库的Gbrowse功能比对成簇分布的PAL基因家族成员与侧翼编码蛋白质基因位置关系，并参考Holub(2001)对基因簇的界定，暗示谷子PAL家族基因可通过串联复制实现家族扩增。
生物研究论文范例：叶绿体TOC-TIC蛋白复合体转运机制研究进展
3讨论与结论
PAL是与植物抗性相关的关键酶(孙宇蛟等，2018)，对其研究也备受关注，前人已经对多物种的PAL基因家族进行了分析，如玉米(邓路长等，2019)、苹果(张丽之等，2018)和陆地棉(GossypiumhirsutumLinn.)(杨郁文等，2017)。
其中玉米和陆地棉均含有13个PAL基因，苹果含有个PAL家族成员，与本研究中谷子鉴定出11个PAL基因结果相差不大，说明PAL基因以小基因家族形式存在，在物种分化过程中没有出现大幅度扩增现象。谷子PAL基因编码的蛋白中有部分蛋白具有相近的分子量、等电点等，与香蕉(杨会晓等，2019)和青天葵(Nerviliafordii)(黄琼林等，2016)的研究较一致，说明其编码的蛋白具有相似的功能。
基因复制事件是基因家族扩张的主要动力。本研究发现，谷子PAL基因呈簇状分布，在苹果(张丽之等，2018)、大豆(候鹏等，2016)、西瓜(Citrulluslanatus)(Dong&Shang,2013)中PAL染色体定位同样存在着簇状分布现象，其中西瓜12个PAL基因中有个串联排列在号染色体，个串联排列在号染色体上，其余单独排列在染色体号、号、号上，与谷子PAL染色体分布有着高度的相似性，说明在PAL基因家族的扩增中存在串联复制、分散复制、片段复制(郭栋等，2019)。
共线性分析发现，11个谷子PAL基因家族成员在水稻染色体组中均存在共线性关系，说明PAL基因在进化过程中保守性较高。根据进化树的拓扑结构，谷子PAL蛋白进化树分为组，SiPAL7独自进化为一支，说明SiPAL7与其他成员同源性较低，可能具有不同起源或进化轨迹，本研究结果与陆地棉(杨郁文等，2017)具有一致性。系谱树内同一进化枝PAL成员基因结构较为一致，具有较高的保守性。但Ⅲ组成员SiPAL7与其他家族成员相比基因结构差异较大，拥有更多的内含子数量，这暗示PAL基因家族具有多样化的转录调控过程。
PAL基因家族成员结构的差异性可能会影响其功能活性。启动子分析发现PAL家族基因不仅含有大量非生物胁迫元件，还存在光响应、激素响应等多种类型元件，不同PAL家族成员所含元件数量和种类不同，说明PAL基因家族广泛参与不同生物学调控过程，不同PAL基因具有其特异调控模式。植物在遭受干旱、高温等胁迫时，会迅速产生大量活性氧(ROS)造成细胞结构损伤。苯丙烷代谢途径中产生的类黄酮等次生代谢产物，具有清除ROS的抗氧化活性(杨会晓等，2019)。
本研究发现，PAL家族基因多为诱导型表达，在受到不同胁迫刺激时，SiPALs表达量迅速提升，说明PAL家族基因广泛响应不同非生物胁迫，类黄酮等次级代谢产物在非生物胁迫过程中可能具有较高的合成活性。同时发现，部分基因具有相似的响应模式，说明SiPALs可能存在功能冗余。光质在植株建成、生长发育过程中具有重要作用。荧光定量分析结果表明，在不同光照条件下，PAL家族基因差异表达。SiPAL5在红光、红远光高表达、SiPAL11在红远光高表达等，这些变化说明PAL家族基因在谷子光调节途径中存在复杂的调控机制，不同PAL基因存在功能分化。
参考文献
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作者：孟亚轩，孙颖琦，赵心月，王凤霞，瓮巧云，刘颖慧
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《谷子PAL基因家族全基因组的鉴定和表达分析》