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发布时间：2022-02-14 11:20所属平台：学报论文发表咨询网浏览： 次
摘要TCP基因作为植物所特有的转录因子家族，广泛参与调控植物的生长发育、代谢、信号转导、生理生化刺激响应及逆境应答等多个生物学过程。本研究利用生物信息学研究方法鉴定获得28个油棕TCP基因家族成员，并对其染色体定位、结构特点、motif、聚类分析及组织表达特
摘要TCP基因作为植物所特有的转录因子家族，广泛参与调控植物的生长发育、代谢、信号转导、生理生化刺激响应及逆境应答等多个生物学过程。本研究利用生物信息学研究方法鉴定获得28个油棕TCP基因家族成员，并对其染色体定位、结构特点、motif、聚类分析及组织表达特异性进行分析。结果表明：共有27个基因在油棕的14条染色体上呈不均匀分布;EgTCP基因的长度均相对较短，其中14个基因只有1个外显子，EgTCP11基因含外显子个数最多(5个);序列分析表明油棕TCP基因均含有高度保守的bHLH结构域，启动子上存在较多的植物激素响应及逆境应答等顺式作用元件;系统进化分析显示28个油棕TCP蛋白被划分为ClassI(13个蛋白)和ClassII(15个蛋白)两大类，其中ClassII进一步分为CYC/TB1(4个蛋白)和CIN(11个蛋白)两个亚类;通过表达模式分析发现花中特异表达的TCP基因数量最多(EgTCP05,EgTCP09,EgTCP15,EgTCP27和EgTCP28)，EgTCP27基因在中果皮中的表达量逐渐上调，到花后23周时表达量升至最大。本研究为进一步探索油棕TCP基因的生物调控功能提供一定的理论基础。
关键词油棕;TCP转录因子;全基因组鉴定;表达分析
TCP基因是植物所特有的一类转录因子，其通过结合下游靶基因的特定结构域来调控植物的生长发育及逆境响应等过程。TCP转录因子的名字是由4个植物基因的首字母组成，分别是玉米基因TB1(TEOSINTEBRANCHED1)(Doebleyetal.,1997)，水稻的两个基因PCF1(PROLIFERATINGCELLTRANSCRIPTIONFACTORS1)和PCF2(PROLIFERATINGCELLTRANSCRIPTIONFACTORS2)(KosugiandOhashi,1997)，金鱼草基因CYC(CYCLOIDEA)(Luoetal.,1996)。
TCP蛋白的N端均包含一段长约60个氨基酸残基的非典型螺旋-环-螺旋bHLH(basis-Helix-Loop-Helix)结构域，该结构域具有DNA结合、蛋白互作和定位等功能(Dhakaetal.,2017)。通过分析TCP蛋白motif的特性，TCP基因成员被分为ClassI和ClassII2大类，其中ClassII又可被分为CIN和CYC/TB1两大亚类。ClassII类蛋白的TCP结构域比ClassI类多4个保守氨基酸残基，此外还具有富含极性氨基酸的R结构域。
TCP转录因子在诸多植物中被鉴定出来，且相关研究表明其参与调控植物的生长发育、衰老及逆境应答等多个生物学过程，如高粱TCP基因家族中的SbTCP21促进早起花序的发育(郑玲等,2019)，甘薯27个TCP基因家族中的CM008331.1-snap.1063基因在低温条件下表达量上调，推测其可能参与调控甘薯的低温应答过程(毕楚韵等,2021)。
油棕属棕榈科多年生木本乔木，是热带地区重要的油料作物之一，也是目前世界上产油效率最高的作物，平均每亩产油量是花生的7~8倍，大豆的9~10倍，享有“世界油王”之美誉(Basrietal.,2005)。有关油棕(ElaeisguineensisJacq.)TCP转录因子家族的报道研究较少。本研究利用相关生物信息学研究手段在全基因组范围内鉴定挖掘油棕TCP家族成员，并对其理化性质及表达特异性进行分析，以期揭示油棕TCP基因家族的特征，为将来进一步研究其在油棕生长发育及胁迫应答过程中的调控机理提供工作基础。
1结果与分析
1.1油棕
TCP基因基本信息基于拟南芥TCP基因序列，在油棕全基因组范围内BLAST搜索TCP同源序列，经过对其蛋白保守结构域的筛选与剔除，最终共鉴定出28个油棕TCP基因。有27个基因在油棕的14条染色体上呈不均匀分布，其中第1、第6和第7条染色体上分布的基因数相同且最多(3个)。油棕TCP基因的长度均较短，其中14个基因只有1个外显子，EgTCP11含外显子个数最多，为5个。该结果表明大部分EgTCP基因均具有相似的基因结构，50%的基因不含内含子，EgTCP家族基因的结构相似可一定程度上决定着其序列进化及其在体内的功能活性。
1.2油棕
TCP蛋白理化性质通过分析28个EgTCP蛋白的理化性质发现(表2)，28个蛋白均定位在细胞外间隙中，8个TCP蛋白呈酸性(理论等电点小于7)，20个EgTCP蛋白呈碱性(理论等电点大于7)，其中EgTCP27蛋白的等电点最小，为5.14，EgTCP9和EgTCP22蛋白的等电点最大，为9.9。利用SOPMA蛋白二级结构预测软件预测EgTCP蛋白的二级结构，发现28个EgTCP蛋白均存在α-螺旋、β-转角、无规卷曲及延伸链这4种结构，其中23个蛋白以无规卷曲为主要结构，α-螺旋为次要结构;5个蛋白以α-螺旋为主要结构，无规卷曲为次要结构，以β-转角及延伸链结构为主的蛋白所占比例均较少。
α-螺旋是蛋白二级结构中最常见的一种结构，其次为无规卷曲，该家族中有23个蛋白以无规卷曲结构为主，受侧链相互作用的影响较大，推测可能会构成酶活性部位及其他蛋白质特异的功能部位，说明EgTCP蛋白大多具有酶活性，可在很多生物学途径中发挥调控作用。
1.3油棕
TCP基因染色体定位28个EgTCP基因中有27个在除第5条和第14条染色体之外的14条染色体上呈不均匀分布。其中第1、第6和第7条染色体上分布的基因数目相同且最多，均分布有3个基因;第2、3、4、9、11、13和15条染色体上均有2个基因，第8、10、12和16条染色体分布最少，均只有1个基因。基因在染色体上的分布相对分散，且同一染色体上的基因间相距较远，推测该家族成员间存在串联重复关系的可能性较小，这可能与油棕基因组的加倍和复制事件有关。
1.4油棕
TCP进化树构建及基因结构应用MEGA6.0软件对EgTCP蛋白序列进行BLAST分析，绘制进化树图。28个EgTCP蛋白被划分为ClassI和ClassII两大类，其中ClassII进一步分为CYC/TB1和CIN两个亚类。ClassI类含有13个蛋白，ClassII(CYC/TB1)亚类有4个蛋白，ClassII(CIN)亚类有11个成员。
EgTCP基因的外显子个数在1~5之间，其中14个基因只有1个外显子，6个基因含有2个外显子(EgTCP0,EgTCP10,EgTCP16,EgTCP17,EgTCP24和EgTCP25)，5个基因有3个外显子(EgTCP01,EgTCP04,EgTCP06,EgTCP1和EgTCP15)，EgTCP03和EgTCP18含有4个外显子，EgTCP11含外显子个数最多，为5个。
在聚类分析上，与其他物种一样，EgTCP家族成员被分为了ClassI和ClassII两大类。ClassI与ClassII所含基因的比例约为1:3，这与其他物种1:1的比例有着较大的不同，这说明在进化过程中，不同物种的基因组中TCP家族成员在串联重复，基因复制等事件上发生了不一样的变化。
1.5油棕
TCP基因motif分析通过MEME在线分析EgTCP蛋白的10种motif类型(命名为motif1~motif10)，发现ClassI类蛋白均含有motif1和motif2;ClassII(CYC/TB1)类的4个蛋白均含有motif1，除EgTCP09外的其他3个蛋白均含有motif3。
此外，EgTCP06和EgTCP15均含有motif4、motif5、motif6和motif7;ClassII(CIN)类11个蛋白均含有motif1和motif8，其中有6个蛋白还含有motif3(EgTCP01,EgTCP02,EgTCP03,EgTCP10,EgTCP11和EgTCP24)。ClassII类与ClassI类相比，ClassII类的motif类型较为复杂，尤其是ClassII(CYC/TB1)亚类含有的motif种类较多，说明该亚类的EgTCP蛋白具有更丰富的功能结构域，可参与相对较多种类的应答调控，但还需更进一步的研究验证。
1.6油棕
TCP蛋白保守结构域通过对油棕TCP蛋白的保守结构域进行分析比对，结果发现28个EgTCP蛋白均含有bHLH结构域，Basic、Helix1、Loop和Helix2区域间存在差异，其中Basic区域保守型最强。ClassI类家族成员均在Basic区缺少4个氨基酸残基，ClassII(CYC/TB1)亚类中的EgTCP09蛋白缺少精氨酸、丙氨酸和苏氨酸，ClassII(CIN)亚类中的EgTCP26蛋白中无双螺旋区的氨基酸。
该结果表明EgTCP蛋白具有较高的序列相似性，油棕在进化过程中保留了EgTCP蛋白家族的功能单元，ClassI类成员能够调控油棕生长发育基因的表达，ClassII(CYC/TB1)亚类成员可参与调控逆境应答基因的表达，ClassII(CIN)亚类成员可能参与油棕激素响应基因的表达。
1.7油棕
TCP基因顺式作用元件为深度了解EgTCP基因家族的调控表达模式，应用PlantCARE在线软件预测EgTCP基因上游启动子所具有的顺式调控元件，结果发现鉴定到了多种应答环境和激素信号的顺式元件(表3)，表明EgTCP表达调控机制较为复杂，可能受内、外因子的多重调控。其中发现与生长素(IAA)相关的作用元件类型最多，其次为赤霉素(GA)。
除上述2类作用元件之外，还鉴定到脱落酸(ABA)、干旱、低温等信号响应相关的顺式作用元件。同时分析了各亚群EgTCP成员所含顺式作用元件的种类，发现ClassI类EgTCP成员启动子区的顺式作用元件种类最为丰富，包括ABA、干旱响应的顺式元件，该结果表明该类群家族成员对油棕抵御非生物胁迫有重要的调控作用。其次为ClassII(CIN)和ClassII(CYC/TB1)亚类，同时包含环境和激素响应元件，推测该类群基因可能对油棕的生长发育具有重要调控作用。
2讨论
TCP转录因子作为一类植物所特有的基因家族，在调控植物的生长、发育、新陈代谢、衰老及逆境响应等方面均具有重要的调节作用，诸多作物的TCP转录因子家族成员相继被挖掘及报道。如大豆(刘洋等,2012)、番茄(阮先乐等,2017)、野生种和栽培种花生(王通等,2021)、拟南芥(Koyamaetal.,2007)和海岛棉花(Lietal.,2017)中分别获得54、36、19、37、24和72个TCP基因成员。
本研究利用生物信息学研究方法对油棕TCP转录因子进行全基因组范围内的鉴定分析，共获得28个TCP基因，其基因总数与其他植物的有所不同，这说明TCP基因在植物中广泛存在，且不同作物间TCP基因家族的基因数量也存在一定的差异。通过序列同源性分析，发现油棕TCP基因与其他作物TCP成员在分子特性和保守结构域等特征上均具有相似性。通过系统进化分析表明，油棕TCP与其他作物一样，被分为ClassI和ClassII两大类，ClassII又进一步分为ClassII(CYC/TB1)和ClassII(CIN)两个亚类，其中ClassI类群共有13个成员，ClassII中有15个，比例约为1:1，这与其他作物的研究结果相一致(Heetal.,2020;Zhaoetal.,2020)。
ClassII15个基因中有11个被分在ClassII(CIN)亚类中，ClassII(CYC/TB1)亚类仅含4个基因，比例约为3:1，油棕TCP家族中CIN类基因的占有比例较高，这说明在植物进化过程中，基因组中TCP基因在复制、加倍或串联等事件上发生了不同的变化。
通过基因结构分析发现，油棕TCP基因高度保守，长度均较短，其中14个基因只含有1个外显子，不含内含子，这与已报道的大多数植物TCP基因无内含子结果相一致(冀志蕊等,2017;Dingetal.,2019;张志强等,2020)。通过MEME在线分析油棕TCP基因家族的10个motif保守基序，其中motif1存在于所有基因成员中，这也是鉴定TCP基因家族成员的重要依据。
此外，聚类分析处于同一分支上的油棕TCP基因具有相似数量的保守基序和排列顺序，不同分枝间的保守基序数存在一定的差别，推测该现象可能是由于TCP基因在进化过程中丢失或新增保守基序引起的，因此聚类分析中遗传关系较近的基因可能功能也相似。
已有研究表明TCP转录因子在植物叶、茎、花等多个组织生长发育过程中起着调控作用(Lietal.,2015;Liuetal.,2019)，关于CYC/TB1和CIN的研究报道更多(HowarthandDonoghue,2006;Tähtiharjuetal.,2012;Belloetal.,2017;LanandQin,2020)。本研究通过EgTCP基因表达矩阵热图分析发现EgTCP基因具有显著的组织特异性表达，其中在花中特异表达的TCP基因数量最多，如EgTCP05、EgTCP09、EgTCP15和EgTCP28，其中EgTCP09和EgTCP15属于CYC/TB1亚类基因，是花中表达量最高的TCP基因，推测其在油棕花的发育中其调控作用。
EgTCP27基因在中果皮中的表达量逐渐上调，在授粉后15周时的FPKM值为52.53，17周时为54.80，21周时67.95，到23周时表达量升至最大，FPKM为110.92，应用定量PCR技术进一步分析了上述5个基因在不同组织中的表达变化，与热图分析的结果较为一致，由此推测其在果实的发育和成熟过程中起着表达调控功能。该结果为研究油棕TCP基因成员的功能研究提供思路。
3材料与方法
3.1油棕TCP家族基因序列获取及筛选鉴定
首先从TheArabidopsisInformationResource(TAIR)数据库中下载获得拟南芥TCP基因序列，以拟南芥TCP基因序列为探针，阈值设定为e-10，在油棕基因组数据库中(GCA_000442705.1)进行同源序列BLASTP检索，从而得到油棕TCP基因序列，将得到的油棕TCP基因序列在美国麻省理工学院在线基因扫描服务器(TheGENSCANWebServeratMIT)搜索以获得TCP蛋白序列，通过NCBI在线工具CDD和PFAM数据库进行蛋白结构域分析，剔除无保守结构域的蛋白序列。
3.2油棕
TCP的染色体定位、基因结构、聚类等可视化分析利用在线软件MapGene2ChromosomeV2.1进行油棕TCP基因染色体定位，应用TBtools软件对其基因结构分析，用Bioedit软件进行保守结构域的预测;利用MEME在线软件分析油棕TCP蛋白保守基序，检索的最大motif数设置为10。
参考文献
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BelloM.A.,CubasP.,ÁlvarezI.,SanjuanbenitoG.,andFuertes-AguilarJ.,2017,EvolutionandexpressionpatternsofCYC/TB1genesinanacyclus:phylogeneticinsightsforfloralsymmetrygenesinasteraceae,FrontPlantSci.,8:589-602.
BiC.Y.,HuangX.F.,WangH.T.,ChenQ.J.,HuY.Z.,HuangB.F.,XuM.,YangZ.J.,ChenX.Y.,andLinS.J.,2021,IdentificationofTCPtranscriptionfactorsinIpomoeabatatas(L.)
Lam.genomeandexpressionanalysisunderstress,ZhiwuKexueXuebao(PlantScienceJournal),39(2):163-172.
(毕楚韵,黄小芳,王和寿,陈其俊,胡韵卓,黄碧芳,许明,杨志坚,陈选阳,林世强,2021,甘薯基因组TCP转录因子鉴定与逆境胁迫表达分析,植物科学学报,39(2):163-172.)
作者：周丽霞赵志浩杨蒙迪曹红星杨耀东
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《油棕TCP转录因子家族生物信息学鉴定及基因表达分析》